緑膿菌線毛蛋白DNAと樹状細胞リガンドDNAワクチンによる緑膿菌肺炎制御の可能性

• Project/Area Number: 21K08508
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 54030:Infectious disease medicine-related
• Research Institution: Oita University
• Principal Investigator: 平松 和史 大分大学, 医学部, 教授 (80301381)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小宮 幸作 大分大学, 医学部, 准教授 (50727550)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2021: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
• Keywords: 緑膿菌 / 線毛 / DNAワクチン / アジュバント / 線毛蛋白 / 緑膿菌線毛 / 樹状細胞リガンド

Outline of Research at the Start

粘膜免疫に着眼した緑膿菌感染症に対する緑膿菌線毛蛋白のDNAワクチンの検討はこれまで行われていない。また粘膜免疫を行う際のアジュバントとして、Flt3リガンドが注目され、このFlt3遺伝子をプラスミドに組み込み、DNAワクチンアジュバントとして用いる検討が近年行われている。Flt3リガンドDNAと他のDNAワクチンを投与し、その効果を検証した研究は少なく、特に緑膿菌感染症に対する検討は行われていない。本研究では、①緑膿菌線毛蛋白のDNAワクチンの経気道的投与の有用性、②Flt3リガンドDNAワクチンとの同時投与による免疫原性上昇の効果をマウスモデルを用いて検討する。

Outline of Annual Research Achievements

前年度作成した緑膿菌標準株であるPAO1株の線毛遺伝子であるpilA遺伝子をT-Vectorに挿入したプラスミドpilA-T-Vectorをcompetent cellである大腸菌に導入し、大腸菌を大量に培養した。培養した大腸菌からプラスミド抽出用キットを用いて、pilA-T-Vectorを大量に抽出した。抽出したpilA T-Vectorを制限酵素で切断し、アガロースゲルにて電気泳動を行い、pilA遺伝子の大きさに該当する450bp付近のバンドを切り出し、DNAを抽出した。抽出したpilA遺伝子をサイトメガロウイルスのプロモーターを有するDNAワクチン用ベクターpVAX1のmultiple cloning siteにligation kitを用いて挿入した。ligation後、competent cellの大腸菌に導入した。pVAX１はkanamycin耐性遺伝子を有しているため、kanamycin含有寒天培地上で遺伝子導入した大腸菌を増殖させることで、プラスミド導入の有無を判別した。発育したコロニーを釣菌し、それぞれをkanamycin含有液体培地で培養し、培養した大腸菌のプラスミドをプラスミド抽出キットにより抽出した。取り出したpVAX1にpilA遺伝子が間違いなく挿入されているかどうかを得られたプラスミドを制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動を行うことで確認した。電気泳動によって450bp付近にバンドが認められたクローンをpilAがpVAX1に導入されたものと判断した。450bp付近にバンドが認められたプラスミドについては、設計通りにpilA遺伝子がpVAX1プラスミドに挿入されているかどうかを確認するため、塩基配列決定の実験準備を行っている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

pilAを挿入したプラスミドT-VectorよりpilA領域を切り出し、DNAワクチン用のプラスミドであるpVAX1とligationし大腸菌に移入後、kanamycin含有培地で選択する実験で時間を要した。最終的にはpilA遺伝子が挿入されたpVAX1を得ることができたが、当初kanamycin含有培地で発育する大腸菌を得ることができず、何度か実験を繰り返し行った。そのために予定したより、やや遅れた状況となっている。さらに、新型コロナウイルス感染症への対応に多くの業務時間を費やす状況が続き、予定していた本研究に対するエフォートを十分に確保できず、計画通りの実験を実施できなかった。

Strategy for Future Research Activity

次年度はpilA-pVAX1プラスミドを細胞内に移入し、抗緑膿菌線毛抗体を用いてin vitroでの線毛蛋白の発現を検証することとしている。それと同時にpilA-pVAX1とFlt3G-DNAプラスミドをマウス気道に投与し、マウス肺洗浄液中の抗線毛蛋白IgGやIgA抗体価の測定等を行うin vivoの実験を開始し、研究計画の遅れを取り戻すようにする予定である。