| Project/Area Number |
21K08633
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
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| Research Institution | Osaka Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
柴田 雅朗 大阪医科薬科大学, 医学部, 功労教授 (10319543)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伊藤 裕子 大阪医科薬科大学, その他部局等, 功労教授 (40148432)
谷口 高平 大阪医科薬科大学, 医学部, 講師 (70779686)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | ｎSM2 / Smpd3 / エクソソーム / ノックアウト / ノックダウン / 乳癌 / 転移 / マウス / nSM2 / 転移抑制 / CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Research at the Start |
癌細胞の分泌するエクソソームは、転移に先立って転移予定先臓器に運ばれ、癌細胞の生着に都合の良い微小環境（前転移ニッチ）を形成すると言われている。そこで、エクソソーム分泌に関わるnSM2、Rab27aあるいはAlixをCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集で転移性乳癌細胞からノックアウトし、ゲノム編集された乳癌細胞を移植し、転移前にセンチネルリンパ節で前転移ニッチの形成が起こるか否かを精査する。また、最終的にエクソソーム関連遺伝子のノックアウトで転移抑制が観察されるかを解析し、エクソソームと転移の関係を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
癌転移の成立には癌細胞の生着に適した転移先臓器での前転移ニッチの形成が必要である。癌細胞の分泌するエクソソームには前転移ニッチを形成する能力があることや転移先臓器を規定するといった報告がある。また、癌の進展に対して促進的に作用しているとも報告されている。転移は癌による死因の殆どを占めていることから、エクソソーム分泌に関わる遺伝子を標的とする治療戦略を試みた。エクソソーム分泌に関わる遺伝子として、Neutral sphingomyelinase 2 (nSM2)、Rab27aおよびAlixの３遺伝子が知られている。そのうち、nSM2はエクソソーム形成の初期段階に関与し、他の経路と非依存的に進行することから、nSM2遺伝子（またはSmpd3と称される）を転移性マウス乳癌細胞において、欠失あるいはノックダウンさせた。マウスnSM2遺伝子のノックアウトベクターの作製と乳癌細胞株への遺伝子導入を株式会社セツロテックに依頼した。３種類のガイド配列を用いた乳癌細胞の中からノックアウト細胞のSingle cell cloneを順次、作製したが、nSM2の発現は完全にノックアウトされず、ノックアウトしていない親細胞の約半分の値を示していた。また、nSM2に対する有効なsiRNA配列を決定し、nSM2-shRNA発現ベクターを作製した。この方法においてもノックダウンは上手く出来なかった。そこで本乳癌細胞株の染色体異常を解析した。nSM2の乗っているのは第８染色体の長腕であるが、染色体解析の結果、第８染色体は８本観察され、そのうち５本は長腕が欠失していた。残り３本は短腕、長腕とも存在していた。この事実から２本の染色体からはnSM2遺伝子をノックアウトできたが、残りの１本の染色体にある当該遺伝子はノックアウト出来なかった可能性があった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
目的遺伝子が欠失した細胞をZsGreen1による緑色蛍光とG418によりセレクションし、引き続き限界希釈により、細胞をクローン化し、ノックアウト細胞の作製を試みていたが、完全にノックアウトされている細胞がクローン化できず、この実験操作を継続していた。また、ノックアウトが出来ない場合を想定して、shRNA発現ベクターを乳癌細胞に組み込み、当該遺伝子をノックダウンさせる実験も行ったが、結果は芳しくなかった。そこで染色体解析を行った結果、完全にノックアウト出来ない理由は当該遺伝子の乗る第８染色体異常に起因するものと考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
作製したnSM2ノックアウト細胞のシーケンス解析を実施し、当該遺伝子がノックアウトされていることを確認する。染色体異常によりnSM2遺伝子のノックアウトが完全に出来ず、ヘテロのような状態になっている可能性があり、Gene dosageのような観点から本細胞株が利用できないかを解析をする。
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