ゼラチンマイクロスフェアを用いた増殖因子投与による人工管腔臓器作製法の開発

Research Project

Project/Area Number	21K08647
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
Research Institution	Nagasaki University
Principal Investigator	内田史武長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 研究協力員 (00866270)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	松本桂太郎長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 准教授 (80404268) 永安武長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (80284686) 町野隆介長崎大学, 病院(医学系), 助教 (90728081) 朝重耕一長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 助教 (70457547) 谷口大輔長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 客員研究員 (20773758) 土肥良一郎長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 客員研究員 (00817786) 高木克典長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 客員研究員 (90635856) 野中隆長崎大学, 病院(医学系), 准教授 (30606463) 岩竹真弓長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 助教 (40624614)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2021)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000) Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2021: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Keywords	幹細胞 / 軟骨分化 / バイオ3Dプリンター / 細胞凝集 / 人工気管 / 成長因子 / ゼラチンマイクロスフェア / 再生医療 / 臓器移植 / 気管移植
Outline of Research at the Start	我々はバイオ3Dプリンターを用いて、Scaffoldを要さない臓器の作製を可能とした。これらの臨床応用における課題は、組織の品質の不安定さであり、解決方法として、増殖因子を用いて幹細胞を分化させることがある。しかし、培養液への増殖因子投与はコストを要する。この解決策として、drug delivery system(DDS)があり、共同で開発中のDDSであるゼラチンマイクロスフェア(GM)に成長因子を吸着させ、人工臓器内に混合し培養することで、低コストで細胞へ成長因子の提供が可能になると考える。この成果が得られれば、人工臓器の大量生産が可能となる。GMを用いた人工臓器作製の臨床応用確立を目指す。
Outline of Annual Research Achievements	我々は幹細胞に成長因子を用いて軟骨に分化させることで，一定の軟骨の品質を得ることを目標にした。成長因子の投与についてはTGF-β super familyやFGF-2を用い，pelletを作製して成長因子の効果を検討した。軟骨の分化度評価においては，Alcian-blue染色，safranin-O染色，Glycosaminoglycan（GAG）量を定量することで行った。その結果，FGF-2とTGF-β3を用いて気管軟骨を作製する方針とした。バイオ3Dプリンターを用い，環状軟骨構造体，馬蹄形軟骨構造体，馬蹄形軟骨構造体に平滑筋を組み合わせた構造体（mimic気管）を作製した。これらいずれも軟骨部はAlcian-blue染色，safranin-O染色，免疫染色（Ⅱ型コラーゲン）で陽性であり，良好に軟骨に分化していることがわかった。mimic気管においては，平滑筋部の免疫染色（α-SMA，SMMHC11）から平滑筋は維持されており，前面を馬蹄形軟骨で，後面を平滑筋で構成された，より実際の解剖構造に近い構造体の作製に成功した。この構造体のラットへの移植にも成功した。また成長因子をより高効率に投与するため，TGF-β1をゼラチンマイクロスフェア（GM）に付加し，構造体内で徐放させる方法についても実験を進め，hMSCを用いた管状軟骨構造体の作製にも成功した。この構造体も特殊染色と免疫染色から軟骨分化を確認できた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初ラットの細胞を用いて人工気管を作製し，それをラットに移植する予定であった。GMを用いてTGF-β1をラットのMSCに投与したが，軟骨分化が得られなかった。成長因子を用いた軟骨分化のコンセプトを保ちつつ他の手段を模索し，ラットではなくヒトの幹細胞を用い，成長因子を選択，これでpelletを作製して最適な成長因子を選定することに時間を要した。またバイオ3Dプリンターによって軟骨構造体を作製に成功したが，より実際の解剖学的構造に近付けるために試行錯誤した。最終的により実際の解剖学的構造に近いmimic気管を作製できた。GMを用いた成長因子投与においては，構造体を作製した後の培地の吟味に時間を要し，最終的に軟骨分化が得られる調整法を獲得した。
Strategy for Future Research Activity	より実際の解剖学的構造に近いmimic気管のラットへの移植に成功しており，この移植モデルの組織学的解析を行う。またブタなど大動物における実験も進めている。GMを用いた成長因子投与についても構造体の作製に成功したため，動物への移植実験を行っていく予定である。