バイオ人工臓器研究における（膜型）レクチンの制御機能の利用

• Project/Area Number: 21K08665
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 正畠 和典 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (40588381)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前田 晃 大阪大学, 大学院医学系研究科, 招へい教員 (00319708)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: Xenotransplantation / 糖鎖認識部位 / SP-A / ブタ血管内皮細胞 / 細胞障害率 / 自然免疫系細胞 / 膜型レクチン / 異種移植 / Transgenicブタ / バイオ人工臓器

Outline of Research at the Start

ヒトGalectin-3、-9及び 肺胞サーファクタントSP-AのCDR（糖鎖認識部位）部分を膜型レクチンの一つCL-1のCDRに置き換え、ブタ血管内皮細胞(SEC)に遺伝子発現させることにより、主にブタ細胞上でのMonocyte/Macrophageの制御、MonocyteのM2-Macrophageへ分化誘導、及び免疫寛容誘導の可能性、同時に好中球に対する反応を検討する。なお、比較に、ヒト組織適合性抗原のclass IbであるHLA-G群を用いる。

Outline of Annual Research Achievements

肺胞サーファクタントSP-Aに目をつけ、そのCRD(糖鎖認識部位)部分を膜型レクチンの一つであるCL-1のCRDに置き換え、pCXN2-Vectorのcloning siteに挿入、pCXN2/CL-SP-Aを作成し、FACSでその発現を確認した。前回はヒトmonocyte/macrophageのcell lineであるTHP-1を使い、ブタ血管内皮細胞(SEC)に対する障害率を検討した。
今回はヒト抹消血からの顆粒球（PBMC）を取り出し、M-CSF(100ng/mL)を加え５日間培養しmacrophageに誘導した後、FACSにてCD14の発現を確認し、同時にSIRPaの発現を検証した。CL-SP-Aによるphagocytosis（貪食）に対する抑制効果を検討した。SECに対するヒトmacrophageの貪食率は約７５％であったのに対し、SEC/CL-SP-Aに対しては約３０％以下の値を示した。また、続いてROS産性能を検討した、SECの場合を１００％とすると、SEC/CL-SP-Aでは約７５％程度に落ちていた。さらに、反応の際のmacrophageでのサイトカイン産性能についてはmRNAを取りrt-PCR法で測定した、SEC/CL-SP-Aに対する場合は、SECに対する場合と比べて、IL-1bの産生に変化は示さなかったが、TNF-aやiNOS/Arg1は有意に下がっていた。一方、IL-10は有意に上昇していた。加えて、THP-1 Lucia NFkB細胞を用いて細胞障害を測定したが、SEC/CL-SP-AではSECに比してやはり有意にNF-kB遺伝子発現がおさえられていた。
これらの事から、hybrid分子CL-SP-AがmacrophageのSECに対する攻撃の際、その抑制に有効であることが証明された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

CL-SP-Aのdeta が出だした。

Strategy for Future Research Activity

CL-SP-Aに関して、今度はヒトneutrophilでのphagocytosis等に対する制御効果を検討していく。
また、Galectin3の検討を行う

Research Products

• [Journal Article] Immunosuppressive effect of a C5a receptor antagonist via macrophage regulation of an intestinal transplant in a rat model (2022)
  • Author(s): Chiyoshi Toyama, Akira Maeda, Shuhei Kogata, Koki Takase, Tasuku Kodama, Kazunori Masahata, Masafumi Kamiyama, Takehisa Ueno, Yuko Tazuke, Hiroshi Eguchi, Katsuyoshi Matsunami, Shuji Miyagawa, Hiroomi Okuyama
  • Journal Title: Transpl Immunol. Volume: - Pages: 101559-101559
  • DOI: 10.1016/j.trim.2022.101559
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A study of the mechanisms responsible for the action of new immunosuppressants and their effects on rat small intestinal transplantation (2022)
  • Author(s): Shuji Miyagawa, Tasuku Kodama, Rei Matsuura, Pei-Chi Lo, Rieko Sakai, Chiyoshi Toyama, Yuichi Takama, Yoshiyuki Ihara, Yoichi Kakuta, Kazuaki Yamanaka, Katsuyoshi Matsunami, Hiroshi Eguchi, Akira Maeda, Hiroomi Okuyama
  • Journal Title: Transpl Immunol . Volume: 70 Pages: 101497-101497
  • DOI: 10.1016/j.trim.2021.101497
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The Innate Cellular Immune Response in Xenotransplantation (2022)
  • Author(s): Akira Maeda, et al.
  • Journal Title: Frontiers in Immunology Volume: in press
  • DOI: 10.3389/fimmu.2022.858604
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Complement regulation in the Triple-KO era, (2022)
  • Author(s): Miyagawa S, Maeda A, Toyama C, Kogata S, Okamatsu C, Yamamoto R, Masahata K, Kamiyama M, Eguchi H, Watanabe M, Nagashima H, Ikawa M, Matsunami K, Okuyama H.
  • Journal Title: Frontiers in Immunol Volume: -
  • DOI: 10.3389/fimmu.2022.860165
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Suppression of macrophage-mediated xenogeneic rejection by the ectopic expression of human CD177. (2022)
  • Author(s): Kogata S, Lo PC, Maeda A, Okamatsu C, Sato K, Yamamoto R, Haneda T, Yoneyama T, Toyama C, Eguchi H, Masahata K, Kamiyama M, Okuyama H, Miyagawa S.
  • Journal Title: Transpl Immunol. Volume: - Pages: 101663-101663
  • DOI: 10.1016/j.trim.2022.101663
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Suppression of xenogeneic innate immune response by a membrane-type human surfactant protein-A. (2022)
  • Author(s): Toyama C, Maeda A, Kogata S, Yamamoto R, Masahata K, Ueno T, Kamiyama M, Tazuke Y, Eguchi H, Okuyama H, Miyagawa S.
  • Journal Title: Exp Ther Med. Volume: - Issue: 3
  • DOI: 10.3892/etm.2022.11527
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The Regulation of Neutrophil Extracellular Trap-induced Tissue Damage by Human CD177 (2021)
  • Author(s): Yoneyama Tomohisa、Maeda Akira、Kogata Shuhei、Toyama Chiyoshi、Lo Pei-Chi、Masahata Kazunori、Kamiyama Masafumi、Haneda Tomoko、Okamatu Chizu、Eguchi Hiroshi、Tazuke Yuko、Ueno Takehisa、Okuyama Hiroomi、Miyagawa Shuji
  • Journal Title: Transplantation Direct Volume: 7 Issue: 8 Pages: e734-e734
  • DOI: 10.1097/txd.0000000000001175
  • Peer Reviewed
• [Presentation] The suppression of macrophage-mediated intestinal transplant rejection by C5a receptor antagonist. (2022)
  • Author(s): Chiyoshi Toyama, Akira Maeda, Shuhei Kogata, Koki Takase, Tasuku Kodama, Kazunori Masahata, Takehisa Ueno, Masafumi Kamiyama, Yuko Tazuke, Hiroshi Eguchi, Katsuyoshi Matsunami, Shuji Miyagawa, Hiroomi Okuyama
  • Organizer: The Transplantation Society 2022
• [Presentation] Effect of a C5a receptor antagonist on macrophage function in an intestinal transplant rat model (2022)
  • Author(s): Chiyoshi Toyama, Akira Maeda, Shuhei Kogata, Koki Takase, Tasuku Kodama, Kazunori Masahata, Takehisa Ueno, Masafumi Kamiyama, Yuko Tazuke, Hiroshi Eguchi, Katsuyoshi Matsunami, Shuji Miyagawa, Hiroomi Okuyama
  • Organizer: The Transplantation Society 2022
• [Presentation] Macrophages in xenotransplantation (2022)
  • Author(s): Shuji Miyagawa, Takuji Kawamura, Hiroomi Okuyama, and Akira Maeda
  • Organizer: ATW 2022
• [Presentation] CPISPR / Cas3 system for pig Gal-T (GGTA1) (2021)
  • Author(s): Shuji Miyagawa, Masahito Watanabe, Kazuki Sato, Shuhei Kogata, Chiyoshi Toyama, Kazunori Masahata, Masafumi Kamiyama, Hiroshi Eguchi, Akira Maeda, Kazuto Yoshimi, Tomoji Mashimo, Hiroomi Okuyama, Hiroshi Nagashima
  • Organizer: IXA 2021
  • Int'l Joint Research