Development of the innovative treatment using self iPS cell for acute liver failure

Research Project

Project/Area Number	21K08685
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 55020:Digestive surgery-related
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	原田昇九州大学, 大学病院, 講師 (80419580)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	戸島剛男九州大学, 大学病院, 助教 (40608965) 武石一樹九州大学, 大学病院, 特別教員 (50733713) 栗原健九州大学, 大学病院, 助教 (50823598) 吉住朋晴九州大学, 医学研究院, 教授 (80363373) 伊藤心二九州大学, 大学病院, 講師 (90382423)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000) Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Keywords	iPS-Heps / 急性肝不全 / 大量培養 / Scaffold / iPS細胞
Outline of Research at the Start	iPS細胞由来肝細胞（iPS-Heps）の急性肝不全の治療効果を検討するために、 ①まずヒトiPS細胞を内胚葉(endoderm)に分化し、single cell passageを施行する。 ②検体から単離したhepatocyteを効率的に増殖させる新規方法を確立する。蛍光免疫染色による細胞確認と機能確認を施行し、さらに癌化しないという安全性確認を施行する。 ③このiPS肝臓細胞を用いて、マウス70％肝切除モデルによって急性肝不全の治療効果を検討する予定である。
Outline of Annual Research Achievements	iPSは急性肝不全を含めた再生医療への応用が期待されるが、肝移植に代わる人工肝臓の作成には至っていない。これまでに我々は脱細胞化したScaffoldにiPSから分化させた肝細胞(iPS-Heps)、胆管細胞、血管内皮細胞を再細胞化したミニ人工肝臓を作成し、作成した人工肝臓は生体内で機能を有することを明らかにし、iPSを用いた肝再生グラフトの可能性を報告した(Cell Rep.2020)。しかしながら、このミニ人工肝臓を臨床応用するためには、サイズアップが必要であり、iPS-Hepsに安全かつ容易に大量培養することが必要と考えた。iPS-Hepsを大量培養する方法として取組んでいるのが、iPS由来星細胞(iPS-Ste)との共培養および免疫不全ラットへの細胞移植である。これまでに我々は脱細胞化したScaffoldにiPSから分化させた肝細胞(iPS-Heps)、胆管細胞、血管内皮細胞を再細胞化したミニ人工肝臓を作成し、作成した人工肝臓は生体内で機能を有することを明らかにし、iPSを用いた肝再生グラフトの可能性を報告した。しかし、このミニ人工肝臓を臨床応用するためには、サイズアップが必要であり、iPS-Hepsに安全かつ容易に大量培養することが必要と考えた。現在iPS-Hepsを大量培養する方法として取組んでいるのが、iPS由来星細胞(iPS-Ste)との共培養および免疫不全ラットへの細胞移植である。独自の方法で分化させたiPS-HepをiPS-Steと共培養しiPS-Hepsの細胞増殖を検討し、その肝細胞としての機能①増殖機能②HGF濃度③肝細胞文化マーカーのチェック④iPS-Steの機能解析⑤経門脈的な細胞移植を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 上記のように①独自の方法で分化させたiPS-HepをiPS-Steと共培養しiPS-Hepsの細胞増殖を検討した。実際にはiPS-Steと共培養したiPS-Hepsは、コントロールである肝星細胞株(LX-2)と共培養したiPS-Hepsと比べ、約2倍の増殖効果を示した(p < 0.001)。 ②iPS-SteとLX-2上清中のHGF濃度は、iPS-Steで有意に高値であり (209 vs 0 ng/ml, p < 0.0001) ③iPS-Steと共培養したiPS-Hepsは、有意に肝細胞分化マーカーの発現も高値であった。しかし、TGFbにて活性化したiPS-SteのHGF分泌は有意に低下し、iPS-Hepsの増殖効果は有意に低下した。このことより活性化していないiPS-SteはiPS-Hepsを増殖させた。 ④次にラットへの細胞移植では、IL-2/Rac2 double KOラットに1.0X106個のiPS-Hepsを経門脈的に細胞移植を施行した。移植後14日目のラット血中よりヒト特異的アルブミン125ng/ml検出し、移植後90日目の摘出肝の免疫染色では、肝細胞の95％以上がヒト特異的タンパク質(アルブミン、STEM121)陽性となり、50X106個(移植前の50倍)のヒト由来細胞を分離することができた。
Strategy for Future Research Activity	今後不活性化iPS-Steとの共培養および免疫不全ラットへの細胞移植によりiPS-Hepsを大量培養するシステム構築を進めており、iPS-Hepsは、iPS-Steと共培養すること、さらに免疫不全ラットへの細胞移植によりiPS-Hepsを大量培養するシステム構築を進めていき、臨床応用するために更なる検討を行って行く方針である。