| Project/Area Number |
21K08729
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55020:Digestive surgery-related
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
奥村 知之 富山大学, 学術研究部教育研究推進系, 特命教授 (10533523)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
寺林 賢司 富山大学, 学術研究部工学系, 准教授 (20509161)
藤井 努 富山大学, 学術研究部医学系, 教授 (60566967)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 血液循環腫瘍細胞 / リキッドバイオプシー / CTC / AI / 画像解析 / 食道癌 / 血液循環癌細胞 / 人工知能 |
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| Outline of Research at the Start |
血液循環癌細胞（CTC）は転移細胞を含むと同時に原発巣の悪性度に関わる情報を有している。近年はCTCのなかでも癌幹細胞マーカーを発現した細胞の検出が重要とされているが、複数のマーカーを用いたCTC検出にむけた簡便かつ高精度な手法の開発が望まれている。近年の人工知能（AI）研究における次世代画像認識機能として畳み込みニューラルネットワーク（CNN）が注目されている。CNNでは機械学習による高い分類精度を得ることができる。本研究では食道癌症例の血液からCTCを捕捉し、細胞表面マーカーに対する多重蛍光染色画像を取得し、CNNを用いた画像解析によって化学療法感受性を識別するAIアルゴリズムを確立する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
食道癌細胞株を用いた条件設定に基づき、さらに高精度のCTC検出法を確立するため、高解像度画像スキャニングを取り入れた。DAPI陽性領域を切り出し光学的ノイズをAIで除去し、大量の細胞を輝度別にマッピングすることでCTCを同定することが可能となった。
前年度に行った食道癌10例の結果をもとに、臨床病理学的因子との関連の検証を進めた。高解像度イメージングスキャンを取り入れたCTC識別アルゴリズムの構築に向けて、膵癌患者38人と健常対照者17人から末梢血を採取し、CD45発現による陰性濃縮ののちEpCAM-PE染色し10,000枚の画像を取得した。細胞画像と非細胞画像を含むアノテーション・ライブラリを用いて機械学習を行い、健常対照者300枚の画像セットを用いて95％の細胞を含むよう輝度閾値を設定した。ROC曲線とAUC解析を行い、癌患者と健常対照者を感度0.74、特異度0.76で識別することができた。
ヒト癌細胞を用いたマウスCTCバイオアッセイモデルの確立:ヌードマウス胃にヒト胃癌細胞株MKN45を移植し36匹中30匹（83.3%）で胃壁内腫瘍の形成を確認した。胃壁内腫瘍はヒト特異的EMA染色にてヒト由来細胞であることを確認した。これらのマウスから血液を採取し、密度勾配遠心法およびCD45陰性濃縮によって細胞を分離し、ヒト特異的EpCAMに対する蛍光染色にてCTCを検出した。30匹中24匹（80.0%）から平均12.5/mlのEpCAM陽性細胞を検出した。24匹中10匹（41.7%）で肝転移を認めた。肝転移マウスおよび非肝転移マウスにおけるEpCAM陽性細胞数（/ml、平均±SD）はそれぞれ13.4±12.9および12.5±12.4と有意差を認めなかった。これらより、EpCAM発現のみではCTC中の転移責任フラクションの同定が不十分である可能性が考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
食道癌細胞株KYSEを用いてCTC捕捉条件を最適化し、また画像撮影の際のサンプル量、露光時間の設定、EpCAMの輝度による背景処理の最適化などに予定以上に時間を要しつつも、各条件の最適化によって安定した画像取得と解析が可能となった。
患者血液を用いたCTC捕捉について、食道癌症例の血液を採取しCTC検出に成功したが、さらなるデータ解析においては、当科にて症例数が多く、また術前化学療法データの揃っている膵癌症例を対象とした研究を開始した。
ヒト食道癌細胞株を用いたマウスCTCモデルの作成については、富山大学動物実験委員会の承認を得て実験を進めたが、マウスへの生着率、EpCAM発現に基づくCTC検出が不安定であったため、ヒト胃癌細胞株MKN45を用いることにより、安定した実験系を確立することができた。
以上より当初の予定以上に時間を要しているものの、研究の方向性が確定し、着実にデータ集積を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．食道癌細胞株を用いたAI画像解析による癌幹細胞識別アルゴリズム作成:高解像度イメージングスキャンとAIを組み合わせた癌幹細胞識別アルゴリズムの作成を進める。
２．患者血液を用いたCTC捕捉とAI解析による癌幹細胞識別アルゴリズムの確立:膵癌症例、食道癌症例を対象としたCTC検出と画像データの蓄積を進め、高解像度イメージングスキャンとAIを組み合わせた癌幹細胞識別アルゴリズムを用いて臨床病期および化学療法効果判定との相関を検証する。
3. ヒト癌細胞を用いたマウスCTCバイオアッセイモデルの確立:胃癌細胞株を用いて、EpCAMに加えて、CSVなど間葉系マーカーを組合わせたCTC検出を行い、肝転移の有無と相関するCTCフラクションの同定を進める。また、上記の高解像度イメージングスキャンとAIを組み合わせた癌幹細胞識別アルゴリズムを用いた解析をマウスモデルに応用する。
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