臨床検体のシングルセル解析による大腸癌幹細胞の代謝機構の解明

• Project/Area Number: 21K08777
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 55020:Digestive surgery-related
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 板倉 弘明 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (90850313)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥崎 大介 大阪大学, 免疫学フロンティア研究センター, 特任准教授(常勤) (00346131) ; 山本 浩文 大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (30322184)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 初代培養 / 大腸癌 / 癌幹細胞 / 代謝 / 代謝機構 / シングルセル解析

Outline of Research at the Start

今回我々は、癌幹細胞を標的とする切り口としてその代謝機構に注目した。大多数の癌細胞がエネルギー産生に解糖系を利用することはコンセンサスを得ているが、癌幹細胞に特徴的な代謝機構は未だに一定の見解が得られていない。その一因として、癌幹細胞を絞り込む手法や、対象とするモデルが一貫していないことが挙げられる。そこで、本研究では、腫瘍微小環境も兼ね備えたPatient-Derived Xenograft (PDX) モデルを対象とし、シングルセル解析により癌幹細胞クラスターを絞り込むことで、癌幹細胞に特徴的な代謝関連遺伝子の発現様式を明らかにし、癌の根治につながる新規治療標的を同定することを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

癌幹細胞とは、自己複製能、多分化能、造腫瘍能を有する少数の癌細胞集団で、治療抵抗性を示し、再発や転移の原因となるため、癌幹細胞を治療標的とする研究が数多くなされてきた。本研究では、特に癌幹細胞独特の代謝機構に注目することとした。
癌細胞周囲の微小環境も血流や、酸素バランス、栄養供給の観点から癌幹細胞の代謝活動には重要と考えられるため、細胞株や単離癌細胞ではなく、癌組織をヌードマウスに移植するPDXモデルを作製して癌細胞とそれを取り巻く微小環境について併せて評価することとした。PDXモデルは間質成分も含んでおり、体内での腫瘍微小環境を再現しているため、微小環境からの影響が大きい代謝機構を評価するのに最も適したモデルと考えた。我々は大腸癌患者の癌組織を採取し、PDXを作製し、4例の大腸癌患者由来の正常大腸粘膜、癌組織、マウスから回収したPDXをそれぞれn=2でRNA-seqに提出して検討したところ、癌組織とPDXの間で目立った代謝分子の変動はみられなかった。癌幹細胞性を高めるにはマウスPDXをマウスに継代してゆくserial transplantation法があるが、相当の時間を要するため、マウスの腫瘍を裁断してスフェロイド培養する方法を試みた。癌細胞をマトリゲルの上に撒く、あるいはマトリゲルの中に埋め込むなどいろいろな培養条件について実験を繰り返し、最終的に安定してスフェロイドを培養して、セルライン化もして凍結保存する方法を確立した。症例を8例に増やし、正常、癌組織、PDX、スフェロイドを各2サンプルずつRNA-seqに提出して解析した結果、解糖系、ミトコンドリア酸化、オートファジーなどの代謝関連分子のうち、解糖系、ミトコンドリア酸化関連分子の変動は僅かであったが、オートファジー関連分子群はダイナミックに大きく変動した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

当初予定していたPDXの解析だけでは有意義な結果は得られなかったが、PDXからスフェロイド培養を実施し、セルライン化する方法を確立したことで、癌幹細胞におけるオートファジーの関係に焦点をしぼることができた。

Strategy for Future Research Activity

RNA-seqから得られた分子群に関して、qRT-PCRで確認する。薬剤抵抗性やスフェロイド形成能、未分化性、造腫瘍性といったどの点にオートファジー分子が関与しているのかを明らかとする予定である。例えばマウスから得た幹細胞性の高いスフェロイドをシングルセル化してオートファジー分子発現を操作したときにステムマーカーや細胞生存能力、次にスフェロイドを造る能力がどのように変化するかどうかなどを検討してゆく。