Development and application of an early detection method for postoperative recurrence of colorectal cancer using tears

Research Project

Project/Area Number	21K08778
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 55020:Digestive surgery-related
Research Institution	Kobe University
Principal Investigator	松田武神戸大学, 医学研究科, 特命准教授 (30782734)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	掛地吉弘神戸大学, 医学研究科, 教授 (80284488) 山下公大神戸大学, 医学部附属病院, 特命准教授 (80535427) 竹内俊文神戸大学, 工学研究科, 名誉教授 (70179612) 谷野裕一神戸大学, 医学部附属病院国際がん医療・研究センター, 特命教授 (50285392) 犬伏祥子神戸大学, 医学研究科, 特命講師 (60585959) 向山順子神戸大学, 医学研究科, 医学研究員 (70734987) 中野秀雄名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (00237348) 藤田貢近畿大学, 医学部, 准教授 (40609997)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Keywords	大腸癌 / 術後サーベイランス / 肺転移 / 肝転移 / エクソソーム / microRNA / miRNA / 涙 / 転移ニッチ / 骨髄由来抑制性細胞
Outline of Research at the Start	本研究は、Liquid biopsy による原発性大腸癌術後症例の早期再発検出法の開発を目的とし、患者検体の採取および解析手段として涙液由来エクソソーム検出法（TearExo 法) を用いる。本手法は ①症例検体集積が簡便であり、迅速な前向き研究が実施可能、②エクソソームを確保するための抗体は変更可能で、病態・患者特異的に最適化したエクソソーム解析が可能、等の利点がある。転移臓器別抗体および患者個別抗体によるエクソソームを検出することで、個別検出を目指した次世代型精密医療の基盤構築を試みる。
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、Liquid biopsy による原発性大腸癌術後再発の早期検出法の開発を目的とし、患者検体の採取および解析手段として涙液由来エクソソーム検出法（TearExo 法) を用いる。本手法は①症例検体集積が簡便であり、迅速な前向き研究が実施可能、②エクソソームを確保するための抗体は選択可能で、病態・患者特異的に最適化したエクソソーム解析が可能、等の利点がある。転移臓器別抗体および患者個別抗体によるエクソソームを検出することで、個別検出を目指した次世代型精密医療の基盤構築を試みる。まず、大腸癌細胞株を用いたエクソソーム検出と確認を行う。採取されたエクソソームをmiRNA検出で確認する。大腸癌細胞株由来や大腸癌原発巣切除例組織（オルガノイド）培養液由来のエクソソームの単球系細胞への影響を検討する。この部分は超遠心とELISA 法で検証する。エクソソームと単球系細胞への影響を検討する。超遠心と ELISA 法で検証し、RNAシーケンスを行う。さらに、大腸癌原発巣切除例のエクソソーム検出と定量を行うために、術前後でTearExo 法の検証を行う。さらに、同系が確立されれば、大腸癌同時性肝転移症例、同時性肺転移症例に対するエクソソーム検出とエクソソームの解析を行う。術前後でTearExo 法でのエクソソーム検証を行う。さらに、原発性大腸癌切除例に対するエクソソーム検出例の集積と観察研究を行い、大規模前向き臨床研究へと進めたい。本研究の成果は、大腸癌の再発の早期検出のみならず、臓器指向性転移の検出方法が期待され、臓器別のフォローを重点的に行うことにより、早期発見と早期治療による治療性の向上を目指すものである。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason エクソソーム解析については、超遠心を行い、ウエスタンブロッティング法にで検出法の検証を行なっており、涙を用いた検出が可能であり、miRNAの採取が可能であることを確認した。しかし、増幅可能なmiRNAは限られるため、条件設定はもうしばらく必要である。大腸癌細胞および単球系細胞の培養液を用いて、エクソソーム検出を行っている。大腸癌細胞（オルガノイド培養）によるエクソソーム検出は現在、進行中である。患者臨床検体に採取に関しては、準備が完了した。まず、小規模のコホートの研究の開始が必要であるため、症例集積を開始した。TearExo に関しては、検出チップの作成は完了しており、大量生産が可能な状態である。また、エクソソーム検出確認のために、胃癌腹膜播種症例を用いて腹水による検出を行った。miRNAの検出に成功し、腹膜播種あり、なし症例における発現の違いが明らかになりつつあり、これを細胞株及びPDXモデルで検証する。転移指向性エクソソームの検出は、転移モデルの構築が必要であり、しばらく時間を要する。
Strategy for Future Research Activity	現在のところ、涙のエクソソーム検出に関連する系の確立は順調である。新型コロナウイルス感染の状況が安定したために、涙採取を全面的に再開しているといった状況である。転移指向性エクソソームの研究に関しては、適切なモデル作成が重要であると考える。