| Project/Area Number |
21K08941
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55050:Anesthesiology-related
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
上野 伸哉 弘前大学, 医学研究科, 教授 (00312158)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古川 智範 弘前大学, 医学研究科, 助教 (60402369)
櫛方 哲也 弘前大学, 医学研究科, 准教授 (80250603)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2025: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000)
Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2021: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
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| Keywords | GABA-A受容体 / トラフィッキング / 麻酔薬作用 / 受容体トラフィッキング / 受容体リン酸化調節 / 麻酔薬 / 受容体リン酸化 |
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| Outline of Research at the Start |
１）GABA-A受容体の脱リン酸化阻害による受容体トラフィッキング制御、およびトラフィッキングによる麻酔効果の調節機構を培養細胞系にて解析する。可視化したGABA-A受容体を発現する培養細胞系を用い、GABA-A受容体のリン酸化部位に変異導入による受容体トラフィッキング変化、麻酔薬効果を解析し、麻酔効果にかかわるリン酸化部位の特定とGABA応答制御にかかわるトラフィッキング機構を探索する。２）GABA-A受容体に結合してトラフィッキング調節に関わるタンパク質の探索を行う。３）変異導入した改変動物の作製し、麻酔作用を評価する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
リン酸化配列部分のGABA-A受容体トラフィッキングへの作用を電気生理学的および組織学的手法を用いた解析を継続した。S408/9E変異beta3サブユニットを野生型alpha、gammaサブユニットと組み合わせても、機能的なチャネル発現は得られず、GABA応答は見られなかった。一方S408/9A変異では機能的チャネルは発現したが、その濃度反応曲線は左側にシフトした。リン酸化部位の変異は、トラフィッキングだけでなく、チャネルの性質にも影響することが明らかとなった
リン酸化部位変異導入した受容体発現細胞と野生型受容体発現細胞の、それぞれに免疫沈降を適用し、新たなトラフィッキング制御タンパク質候補の同定を行った。免疫沈降によって見られた特異的バンドの質量分析を行い、そのタンパク質が14-3-3σであることを同定した。さらに14-3-3σタンパク質が野生型beta３サブユニットおよびリン酸化部位への変異導入（S408/9A とS408/9Eの2種）beta３サブユニットと結合能の有無を免疫沈降法により解析した。野生型beta３サブユニットには結合するが、リン酸化部位に変異導入したbeta３サブユニットとは結合しないことが示唆された。
さらにこの同定したタンパク質が、GABA-A受容体トラフィッキングへの影響をsiRNAを用い、機能解析を行った。si14-3-3σによる14-3-3σノックダウンにより、GABA-A受容体beta３サブユニットの細胞内分布を免疫組織学的に解析した。14-3-3σノックダウンにより細胞膜のbeta３サブユニットの染色性が減弱し、Western blotによっても、タンパク質レベルでの減弱が見られた。以上の結果から14-3-3σは、GABA-A受容体beta３サブユニットと相互作用し、膜へのGABA-A受容体トラフィッキングを制御することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）リン酸化配列部分のGABA-A受容体のトラフィッキングへの作用を電気生理学的および組織学的手法を用いた解析により、トラフィッキングのみならず、チャネル性質への効果も明らかにした。
２）リン酸化部位に変異導入したbeta３サブユニットと野生型のbeta３サブユニットの発現細胞を用い、免疫沈降によって新たなトラフィッキング制御タンパク質候補を明らかとし、質量分析によりそのタンパク質を同定した。
３） ２）で同定したトラフィッキング制御タンパク質の機能解析、実際にGABA-A受容体に結合すること、GABA-A受容体が細胞内から細胞膜へトラフィッキングの過程で制御することを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）リン酸化部位に変異を導入したGABA-A受容体の麻酔薬の感受性への影響を解析する。
２）同定したタンパク質がGABA-A受容体に結合することを確認したので、次に膜への移行メカニズム解明にむけて免疫沈降等の解析を加える。
３）GABA-A受容体のトラフィッキングに関与する部位としてパルミトイル化部位などのリン酸化部位以外の可能性を探る。
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