| Project/Area Number |
21K08941
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55050:Anesthesiology-related
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
上野 伸哉 弘前大学, 医学研究科, 教授 (00312158)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古川 智範 弘前大学, 医学研究科, 助教 (60402369)
櫛方 哲也 弘前大学, 医学研究科, 准教授 (80250603)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2025: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000)
Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2021: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
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| Keywords | GABAA受容体トラフィッキング制御 / 受容体リン酸化 / 14-3-3タンパク質 / GABA-A受容体 / トラフィッキング / 麻酔薬作用 / 受容体トラフィッキング / 受容体リン酸化調節 / 麻酔薬 |
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| Outline of Research at the Start |
１）GABA-A受容体の脱リン酸化阻害による受容体トラフィッキング制御、およびトラフィッキングによる麻酔効果の調節機構を培養細胞系にて解析する。可視化したGABA-A受容体を発現する培養細胞系を用い、GABA-A受容体のリン酸化部位に変異導入による受容体トラフィッキング変化、麻酔薬効果を解析し、麻酔効果にかかわるリン酸化部位の特定とGABA応答制御にかかわるトラフィッキング機構を探索する。２）GABA-A受容体に結合してトラフィッキング調節に関わるタンパク質の探索を行う。３）変異導入した改変動物の作製し、麻酔作用を評価する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度はGABA-A受容体の膜局在と機能制御におけるβ3サブユニットのリン酸化の役割、ならびにその調節因子として14-3-3σタンパク質の機能解析を進めた。
GABA-A受容体は中枢神経系の主要な抑制性シナプス受容体であり、β3サブユニットのS408/9部位のリン酸化が受容体のトラフィッキングと膜局在に関与することを解明した。さらに本研究では、S408/9部位をアラニン（A）またはグルタミン酸（E）に置換した変異体を安定発現させたNeuro2A細胞およびHEK293T細胞を用いて解析を行った。
Neuro2A細胞を用いて、S408/9部位のリン酸化・脱リン酸化を模倣した変異体（S408/9EおよびS408/9A）を安定発現させ、GABA応答および麻酔薬（ジアゼパム・プロポフォール）による感受性の変化を電気生理学的に解析した。S408/9E変異体は膜への局在が著しく低下し、GABA応答も消失したことから、リン酸化がトラフィッキングおよびチャネル機能に関与することが示された。
免疫沈降と質量分析を併用して、トラフィッキング制御に関与する候補タンパク質を同定し、その中から14-3-3σタンパク質を抽出した。14-3-3σは野生型β3サブユニットと結合するが、リン酸化部位変異体とは結合しなかった。さらに、14-3-3σをsiRNAでノックダウンすると、β3サブユニットの膜局在が著しく減弱し、トラフィッキングに必須であることが明らかとなった。逆に14-3-3σタンパク質の調節因子としての役割を、発現増強させてGABA-A受容体の膜局在を解析した。
またGABA-A受容体の他の翻訳後修飾、特にパルミトイル化部位とリン酸化との関与についても検討を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1)トラフィッキング制御因子の同定：免疫沈降と質量分析により、野生型β3サブユニットに特異的に結合するタンパク質として14-3-3σを同定。
2)結合特異性の検証：14-3-3σはS408/9部位を変異させたβ3サブユニット（S408/9AおよびS408/9E）とは結合せず、リン酸化状態依存的な結合であることを確認。
3)機能的解析：14-3-3σをsiRNAでノックダウンすると、β3サブユニットの膜局在が低下し、Westernblotおよび免疫染色により確認された。
4)電気生理学的解析：S408/9E変異体ではGABA応答が消失し、S408/9A変異体ではEC50が低下（感受性の増加）した。また、ジアゼパムおよびプロポフォールによるGABA応答の増強効果は変異の有無にかかわらず維持されていた。
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| Strategy for Future Research Activity |
次神経細胞培養への展開：より生理的条件で14-3-3σの機能を評価するため、急性脳スライスを用いた電気生理学的解析へと発展させる予定である。
パルミトイル化部位の機能的関与：リン酸化部位以外の翻訳後修飾（特にC末端のパルミトイル化）に注目し、トラフィッキング・機能調節への関与を解析する。
14-3-3ファミリー内での特異性評価：σ以外の14-3-3アイソフォームとの相互作用を比較解析することで、より選択的な制御機構を明らかにする。
ヒトGABA-A受容体サブユニットを用いた系の構築：ヒト型のα1/β3/γ2構成による安定発現株を作成し、薬剤感受性や膜移行の評価に展開する
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