Pathophysiological investigation for skeletal deformities of musculocontractural Ehlers-Danlos syndrome using iPS and genome-editing tool
| Project/Area Number |
21K09246
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 56020:Orthopedics-related
|
|---|
| Research Institution | Shinshu University |
|---|
Principal Investigator |
岳 鳳鳴 信州大学, 学術研究院医学系, 助教 (20532865)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
|
| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
|
|---|
| Keywords | iPS疾患モデル / エーラス・ダンロス症候群 / 脊椎変形 / CHST14遺伝子変異 / 疾患iPS細胞 / ゲノム編集技術 / 筋拘縮型EDSの疾患モデル |
|---|
| Outline of Research at the Start |
エーラス・ダンロス症候群は、皮膚・関節の過伸展性 、各種組織の脆弱性を特徴とする遺伝性結合組織疾患である。筋拘縮型EDS (mc EDS)は、CHST14またはDSE遺伝子の変異に基づくEDSの新病型（mcEDS）である。進行性脊椎の変形は頻繁に起きる深刻な合併症であり、患者のQOL/ADL低下を招く。本研究は患者由来のiPS細胞用いて、骨のような小結節を分化誘導し、骨形成のプロセス全体をモデル化することで、骨格変形の発症を解明することである。そして、疾患の原因となるCHST14遺伝子の変異、あるいは、それによる影響を取り除くことを試み、新規治療法の探索に役立つ可能性がある知見を導き出す。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
エーラス・ダンロス症候群（EDS）は皮膚・関節の過伸展性、各種組織の脆弱性を特徴とする先天性疾患の総称であり。本学は、D4ST1をコードするCHST14遺伝子の変異によって起きるmcEDSを見出した。EDSの様々な型において認められ、骨の変形が進行し、高度になると、体幹バランスの悪化、呼吸機能障害、摂食障害などを生じ、患者のQOL / ADLを低下させる最も重要な症状の一つである。しかし、患者から組織サンプルを取得するのは困難であり、たとえ組織サンプルが得られても個々の細胞タイプの正確な分析が難しく、骨芽細胞から骨細胞への移行などの一過性のイベントを観察するのはほぼ不可能である。また、骨格変形が遅発 性ための動物モデルでの研究は限られている。それらのことから、発症メカニズムは明らかになっていない。本研究の目的は、患者由来のiPS細胞用いて、骨形成のプロセス全体をモデル化することで、骨格変形の発症を解明することである。昨年度は、既に樹立したmcEDS-CHST14患者の皮膚繊維芽細胞由来iPS細胞（A108, A279, A280）と、対照としてCHST14変異のない正常iPS細胞（253G）を用い、骨形成分化の過程を模倣した段階的分化法で骨様結節の形成を試みた。骨形成細胞の分化過程において、各段階の骨細胞の遺伝子発現を解析し、カルシウム沈着量を測定した。mcEDS-CHST14 患者の皮膚では、コラーゲン線維の集合の障害が観察された。今年度は、骨形成系統におけるコラーゲンとデコリンの分布を調べるために、骨形成分7日目にそれらの遺伝子とたんぱく質の発現を評価した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
WTおよび mcEDS-CHST14 iPSC は、自然な発生を模倣するプロトコルを使用して骨に分化した。骨分化のさまざまな段階ののマーカーの発現を qRT-PCR によって確認した。骨形成の重要な調節因子をコードするRUNX2の発現レベルは、患者由来のiPSCよりWT由来のiPSCで有意に高かった。 これは、mcEDS-CHST14 患者由来の iPSC における骨形成の遅延の可能性を示した。OCNは骨芽細胞によってのみ分泌する。7日目には、OCNの発現はすべてのiPSCで上方制御されたが、患者由来iPSCではWT由来iPSCと比較して上方制御のレベルが低かった。10 日目に、WTおよび患者由来iPSCではPHEX発現の有意な増加が観察されましたが、A280 由来細胞では観察されなかった。
骨形成におけるコラーゲンとデコリンの分布を調べるために、遺伝子とたんぱく質の発現を確認した。WT由来iPSCと比較して、患者由来iPSCでは COL12A1の発現が高く、DCNの発現が低い。さらに、患者由来iPSCA280では、DCN 発現の低下は顕著でした。免疫細胞化学的染色プロファイルにおけるI型コラーゲンの分布は、7日目では群間で有意な差を示さなかったが、デコリン染色は患者由来iPSCよりもWT由来iPSCで強かった。これらの結果は、mcEDS-CHST14 iPSC 由来骨形成細胞におけるデコリン発現の低下と不十分なカルシウム沈着の間の仮説上の関連性を解明した。
まとめると、我々の発見は、CHST14 変異がアリザリン染色とカルシウム石灰化の減少をもたらし、最終的には mcEDS-CHST14 患者特異的 iPSC の骨形成障害を引き起こすことを示した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
このプロジェクトには二つの骨格がある。その一つは、患者由来のiPS細胞用いて、骨のような小結節を分化誘導し、骨形成のプロセス全体をモデル化することで、骨格変形の発症を解明することである。二つ目は正常なiPS に疾患の原因となるCHST14遺伝子をknockoutして、CHST14遺伝子の変異がある患者のiPS細胞が由来する骨と同じ特徴があるか解析する。令和５年度はIn vivoで骨の形成とゲノム編集の着手である。ゲノム編集について、正常なiPS細胞に、CRISPR-Cas9システムを用いて、CHST14遺伝子変異の導入を行う。これも骨形成細胞の分化過程の各種類の細胞の遺伝子発現とカルシウム沈着量を測定する。
|
Report
(2 results)
Research Products
(3 results)
