各分化段階の骨芽細胞に対するIV型コラーゲンの作用の違いに関する研究

• Project/Area Number: 21K09260
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56020:Orthopedics-related
• Research Institution: Nippon Veterinary and Life Science University
• Principal Investigator: 添田 聡 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 教授 (90318569)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2021: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
• Keywords: VI型コラーゲン / 骨芽細胞 / エンドトロフィン / NG2 / TEM8 / 遺伝子ノックダウン / ラット / ウシ / 骨膜 / 一次オステオン / 骨形成

Outline of Research at the Start

骨膜において、骨芽細胞の分化の制御や新生骨形成部位の決定には骨膜微小環境を構成する細胞外基質が深く関与していることが予想されるが、詳細は不明である。申請者は、長管骨の骨膜において、VI型コラーゲンが骨芽細胞の動態を制御することによって、新生骨形成パターンの決定していることを強く示唆する結果を得た。このことから、骨膜のVI型コラーゲンが受容体を介して骨芽細胞の分化や骨基質産生を制御することによって、規則的な新生骨形成を調節していることが示唆される。本研究では、各分化段階の骨芽細胞の分化および骨基質産生に対するVI型コラーゲンとその受容体の作用を明らかにすることを計画した。

Outline of Annual Research Achievements

・研究1骨膜の骨芽細胞におけるVI型コラーケン受容体(NG2とTEM8)の発現とVI型コラーケン（Col6）沈着領域の関連性に関する研究：免疫組織化学的検索の結果、生後7-28日齢のラット大腿骨骨幹部では、1次オステオン内vascular cavityにおいて、RUNX2陽性骨芽細胞系細胞の大部分にエンドトロフィン受容体であるTEM8の発現が認められた。以上の結果から、細胞内でCol6が切断され、可溶性因子として細胞から分泌されるETPは、骨膜の骨芽細胞の分化成熟過程に何らかの作用を及ぼしている可能性が示唆された。
・研究2 各分化段階の骨芽細胞に対するVI型コラーゲン（Col6）とエンドトロフィン（ETP）の作用に関する研究：ラット初代培養骨芽細胞において、骨基質産生誘導直後にはCol6添加（72時間）によってALP活性の有意な減少が認められたが、誘導後5日目および10日目ではALP活性の変化は認められなかった。ETP添加（72時間）では骨基質産生誘導直後から10日目に、ALP活性の有意な減少が認められた。以上の結果から、Col6およびETPは共に骨基質産生能を持つ骨芽細胞へと分化した初期の段階で、成熟および骨基質産生能を抑制するものと考えられた。さらに、ETPは、骨芽細胞へ分化成熟過程を通して、成熟と骨基質産生能を抑制することが示唆された。
・研究3骨芽細胞の分化・成熟におけるVI型コラーケン受容体(NG2とTEM8)の関与に関する研究：shRNAによるNG2遺伝子のノックダウンを行った結果、ラット初代培養骨芽細胞およびマウス骨芽細胞細胞株MC3T3E1において、骨基質産生能誘導前では、細胞増殖の有意な減少が認められた。以上の結果から、骨基質産生能を獲得する前の未成熟な骨芽細胞においては、Col6はNG2を介して細胞増殖を促進しているものと考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

今回計画したウシの大腿骨骨膜における免疫組織化学において、ウシのTEM8に特異的に反応する抗体の選択に長時間を要したため、当初予定していたウシの骨芽細胞におけるTEM8の発現の詳細な検討がなされていない。
今年度は、市販のリコンビナントETPによる骨芽細胞への作用を確認することができ、予測していた通り、ETPによる骨芽細胞の成熟の抑制を確認できた。また、Col6の添加による変化が骨芽細胞の成熟段階で異なっていることが確認された。
RNAi法による遺伝子ノックダウウンの実験において、レンチウィルスベクターを用いたshRNA法を実施することによって、初代培養骨芽細胞および骨芽細胞株で遺伝子のノックダウンを成功させることができた。しかしながら、効率の良いトランスフェクションが可能なベクターの選択に長時間を有したため、骨基質産生能を誘導した後の遺伝子ノックダウウンによる変化に関しては解析が充分実施できなかった。

Strategy for Future Research Activity

・研究1 緻密骨骨幹部骨膜の骨芽細胞におけるVI型コラーケン受容体(NG2とTEM8)の発現とVI型コラーケン（Col6）沈着領域の関連性に関する研究：ウシの大腿骨骨膜に分布する骨芽細胞におけるTEM8の発現とCol6沈着部位との関連性を免疫組織学によって詳細に検索する。さらに、受容体型と可溶型のTEM8の発現を免疫組織化学的にあるいはin situ hybridization法によって解析する。
・研究2 各分化段階の骨芽細胞に対するCol6とETPの作用に関する研究：骨基質産生誘導後のラット初代培養骨芽細胞および骨芽細胞株に対するCol6およびリコンビナントETPの作用を、骨基質を構成する種々のタンパク質の発現の変化、および骨芽細胞分化を制御する因子、骨細胞への分化を制御する因子の変化に関してさらに詳細な解析を実施する。また、骨髄内および骨膜内の間葉系幹細胞を用いて、骨芽細胞への分化に対するCol6とETPの作用を解析する。
・研究3 Col6受容体の骨芽細胞分化の影響：NG2遺伝子ノックダウンによる骨基質産生能の変化を、さらに詳細に検索し、NG2を介したCol6の作用を解析する。また、Col6、ETP（Col6a3）およびTEM8の遺伝子ノックダウン細胞を作製し、骨芽細胞分化への影響を解析する。