アクネ菌による前立腺癌発生メカニズムの解明

• Project/Area Number: 21K09401
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56030:Urology-related
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 蘆田 真吾 高知大学, 教育研究部医療学系臨床医学部門, 講師 (80380327)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大畑 雅典 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 教授 (50263976) ; 坂本 修士 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 教授 (80397546)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 前立腺癌 / アクネ菌

Outline of Research at the Start

前立腺癌の原因は未だ不明だが、病原体感染がその原因の一つであると考えられている。申請者らは、これまでにRNA-seq解析を行い、アクネ菌を有力な病原体候補として同定した。さらに、前立腺正常上皮細胞にアクネ菌を感染させマイクロアレイ解析を行ったところ、癌化に重要なpathwayに含まれる2種類の遺伝子（遺伝子A、B）の発現が低下することを発見した。本研究は、アクネ菌によるこれらの遺伝子発現低下のメカニズムについて研究を進め、前立腺癌発生の病態を解明し、予防に応用することを目的とする。アクネ菌による前立腺癌発生メカニズムが解明されれば、除菌等により前立腺癌の予防に貢献できる可能性がある。

Outline of Annual Research Achievements

研究代表者は、これまでにRNA-seq解析を行い、アクネ菌を前立腺癌の有力な病原体候補として同定した。そして、前立腺正常上皮細胞にアクネ菌を感染させマイクロアレイ解析を行ったところ、有意な変動を認めるpathwayが存在し、その中で癌化に重要なpathwayに含まれる遺伝子Aの発現が有意に低下することを発見した。遺伝子Aの遺伝子発現低下機序の解明のため、アクネ菌を前立腺上皮細胞に感染させ電子顕微鏡で観察したところ、アクネ菌は細胞内に侵入し、核周囲明庭に存在することが分かった。次に、アクネ菌が産生するタンパク質が遺伝子Aのプロモーターに作用すると仮定し、遺伝子発現を抑制するかどうかについて調べるため、プロモーターアッセイを行った。遺伝子Aのプロモーター領域をPCRで増幅しベクターにクローニングしてレポーター・プラスミドを作製した。そして、レポーター・プラスミドをトランスフェクションした前立腺上皮細胞にアクネ菌を感染させ、ルシフェラーゼアッセイを行ったところ、遺伝子Aのプロモーター活性の低下を認めた。そこで、遺伝子発現低下に関わるプロモーター領域を特定するため、遺伝子Aのプロモーター領域の欠失変異を作製し、今後、ルシフェラーゼアッセイを行う予定である。現在、50塩基で全プロモーター領域をオーバーラップするように欠失変異を作製中である。一方、アクネ菌感染によりpathwayに変化が起きるかどうかについても解析中である。
本研究は、アクネ菌による遺伝子Aの発現低下さらにはpathway変動のメカニズムについて研究を進め、前立腺癌発生の病態を解明し、予防に応用することを目的とする。前立腺癌発生におけるアクネ菌の役割が同定、解析されれば、病態解明につながるだけでなく除菌等により前立腺癌の予防に貢献できると考えられる。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

現在までの進捗状況としては、当初の計画より遅れている。その理由として、アクネ菌感染により有意な変動を認めた重要なpathwayに注目して、その検証実験を追加で行っていることが挙げられる。また、正常前立腺上皮細胞を用いていることやアクネ菌の活性が考えられる。正常細胞は増殖が遅く、継代できる回数にも限りがあるため、常に新しいものを使う必要がある。また、アクネ菌も古いものは活性が低下するため、常にフレッシュなものを使用しなければならない。そうなると必然的に時間と労力を要する。それに加えて、コロナ禍における実験試薬や器具等の納入の遅れも少なからず進捗に影響している。

Strategy for Future Research Activity

アクネ菌感染により有意な変動を認めた重要なpathwayの検証実験を引き続き行う。
遺伝子Aのプロモーター領域の欠失変異を作製し、アクネ菌由来タンパク質が作用し遺伝子発現を調節する部位を特定する。
特定した遺伝子プロモーター部位配列に結合するアクネ菌由来タンパク質をDNAプルダウンアッセイおよびLC-MS/MSにより同定する。まず、特定したプロモーター領域の遺伝子配列に相当するビオチン化DNAプローブを用いてアクネ菌由来タンパク質と複合体を形成させ、タンパク質-DNA複合体をサンプルから選択的に抽出し精製する（DNAプルダウンアッセイ）。そして、タンパク質をDNAから溶出させて質量分析による同定を行う（LC-MS/MS）。同定されたタンパク質は目的とする遺伝子のプロモーターに結合するアクネ菌由来タンパク質である。
アクネ菌の前立腺への感染が発癌に与える影響についてin vivoで検証する。C57BL/6Jマウスに経尿道的にカテーテルを挿入し膀胱および前立腺にアクネ菌を植菌する。植菌後2日、1週間、2週間、8週間目に安楽死させ前立腺および膀胱を摘出し病理組織学的検討としてHE染色および各種免疫組織化学染色を行う。以後は実験結果に応じて動物実験を計画し実施する。