| Project/Area Number |
21K09732
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56060:Ophthalmology-related
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| Research Institution | Osaka Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
二木 杉子 大阪医科薬科大学, 医学部, 講師 (00403014)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 基底膜 / ライブイメージング |
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| Outline of Research at the Start |
血管の形成や機能に重要な役割を果たす基底膜の形成維持機構や動的変化を明らかにすることを目的とし、網膜血管系をモデルとして以下の解析を行う。
(1) 基底膜イメージングモデルマウスNid1-mCherry-TGの網膜の器官培養と血管基底膜ターンオーバー可視化
(2) Nid1-mCherry-KI（ノックイン）マウス作製、より生理的な条件下で網膜血管基底膜のターンオーバー解析
(3) MMP阻害剤等を添加することで基底膜ターンオーバーに影響を及ぼす因子の探索
(4) 未熟児網膜症モデルにおける病的血管の基底膜ターンオーバーの解析
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は血管の形成や機能に重要な役割を果たす基底膜の形成維持機構や動的変化を明らかにすることを目的としており、基底膜イメージングモデルマウス（Nid1-mCherry）を用いて生体内（生組織）での基底膜のライブイメージングによる解析をおこなっている。
2022年度までの研究で、Nid1-mCherryマウス組織における基底膜蛍光標識の評価と、網膜血管基底膜のライブ観察を行い、それらの成果を2023年度初頭に論文として報告した（Futaki et al., Matrix Biol Plus）。2023年度はひきつづきNid1-mCherryマウス網膜血管のライブ観察を用いた研究を行ない、基底膜の形成・分解に関わるマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）の影響を検討した。具体的には、Nid1-mCherryマウス網膜の血管基底膜に対して局所的なレーザー照射により蛍光を褪色させ、新たなNid1-mCherry分子の集積によると考えられる蛍光回復をライブ観察により観察・計測した。この器官培養系にMMP阻害剤を添加した条件下で基底膜蛍光の回復を計測したところ、基底膜蛍光の回復程度に有意な変化は見られなかった。さらに、基底膜成分の相互作用に影響を及ぼすことが予想される因子の存在下での蛍光回復も検討したが、いずれも基底膜におけるNid1-mCherry蛍光の回復に有意な差が見られなかった。今後、複数の阻害剤を検討するほか、添加した薬剤の効果を検証するための網膜血管の培養系の見直しも含めた検討を継続している。
また、マウス内在Nidogen-1遺伝子に蛍光タンパク質をノックインした新たな基底膜イメージングモデルマウスの作製を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
Nid1-mCherryマウス出生率が低く、阻害剤等を用いた実験の再現性の確認などに時間を要した。また、当初計画でmCherryをマウスNidogen-1遺伝子座にノックインしたマウス（Nid1-mCherry-KI）の作製を予定しており、2023年度中に蛍光タンパク質の種類を変更することも含めた共同研究として作製に着手した。しかしマウス系統の樹立が予定よりもおくれている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ひきつづきNid1-mCherryマウスを用いて、網膜血管基底膜のライブ観察と基底膜を継続的に維持する機構の解析を進め、より効果的な実験系の改変と阻害剤の種類や濃度の検討を行う。また、マウスNidogen-1遺伝子座に蛍光タンパク質をノックインしたモデルマウスの作製と解析を進める。色変換型の蛍光タンパク質等を用いることにより、基底膜の動態をより詳細に解析できるモデル系の作出を目指す。なお当初の研究計画にあった病態モデル未熟児網膜症モデルマウスを用いた基底膜蛍光の解析は、大学業務との時間的兼合いにより見送ることとした。
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