Elucidation on pathophysiology of immune-mediated dry eye disease by depleting senolytic reagents

• Project/Area Number: 21K09752
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56060:Ophthalmology-related
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 小川 葉子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師(非常勤) (30160774)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: ドライアイ / 移植片対宿主病 / 造血幹細胞移植 / 眼免疫 / 老化細胞 / 間葉系細胞 / マクロファージ / T細胞 / 眼移植片対宿主病 / 免疫応答 / 慢性移植片対宿主病 / 老化細胞除去剤 / 細胞老化関連分泌形質

Outline of Research at the Start

移植片対宿主病 (GVHD) 涙腺、眼表面には老化細胞の浸潤と細胞老化関連分泌形質(SASP）は炎症と線維化の病態の発症と遷延化に関与する（Yamane M,Ogawa Y, et al. FASEB J 2020 ）。GVHD涙腺、眼表面の老化細胞に係る分子基盤を調べ、各種老化細胞除去薬の効果を検討する。
1) 眼 GVHD における老化T細胞、マクロファージ、間葉系細胞のサブセットの特定とその局在および動態の解明　2) 眼GVHD におけるSASPと病態機序に関わる分子基盤の解明　3) 各種老化細胞除去剤による前臨床Proof of concept の確立と臨床応用への準備を目標にする。

Outline of Annual Research Achievements

GVHDマウスモデルにおける老化関連分泌形質（Senecence-associated secretory phenotype;SASP)を分泌するの老化細胞の細胞源の解明を目標としてGVHDマウスモデルのマクロファージ、T 細胞、B 細胞、樹状細胞について、フルオサイトメトリーを用いて老化細胞マーカーを組み合わせて主にフルオロサイトメトリーによる解析をコントロールと比較し研究を遂行した。骨髄移植の要である放射線照射装置の不具合により一時実験の遂行に遅れを生じたが2022年7月より装置が安定し、その後は順調に遂行することができた。その結果、GVHDマウスモデルにおいてはCD153陽性PD-1陽性T細胞がコントロールに比較して著明に増加していた。B細胞についても検討を行い、GVHDマウスモデルの末梢血においてコントロールに比較して有意に老化B細胞が増加していることを見出した。これらの変化をGVHDマウスモデルで経時的に移植前、移植後2週後、3週後、4週後、5週後と検討し、GVHDとコントロールマウスとの間に、有意な差を認めるにいたっている。これらの変化とSASPの変化との関連も検討中である。骨髄移植後のGVHDマウスモデルで、T細胞とB細胞両者が老化していることを見出した。樹状細胞についてはまだ検討が不十分であり、有意な差を認めるまでにはいたっていない。

ファイブロサイトについてはT細胞、B細胞との共培養を目標に涙腺、マイボーム腺からの培養細胞の樹立を試みた。マイボーム腺からの培養細胞では継代培養に成功している。今後老化T細胞、B細胞とファイブロサイトとの共培養から病的関連因子をSASPとの関連を含めて特定していく予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2022年度　最初の3か月間、骨髄移植に必要な大型機器である放射線照射装置に不具合が生じて修理が必要となった。そのあいだの骨髄移植が行えなかったため研究の遂行に遅れが生じた。

Strategy for Future Research Activity

老化細胞除去薬 による病態抑制の検証 (2023年度)
近年加齢性疾患に対して有効性が報告されている選択的老化細胞除去薬 (① 抗アポトーシスタンパク質 BCL-2 および BCL-xL の特異的阻害剤であるABT-263、②ダサニチブ＋ケルセチンの併用療法) をGVHDマウスモデルに投与し、移植後28日目のGVHD各標的臓器におけるSASP 関連分子 (IL-1β, IL-6, IL-8, CXCL1, CXCL9, TGF-β, オステオポンチン) の発現抑制の有無を遺伝子と蛋白レベルで対照薬投与群と比較検討する。老化細胞除去剤 (ABT-263) 投与によりGVHDマウス涙腺の線維化がABT-263の投与により容量依存的に 線維化面積の減少を認め涙液が増加することの再現性を得る。Image J (NIH) を用いて標的臓器の単位面積あたりの線維化面積、炎症細胞浸潤数について検討する。1) ABT-263については25mg/dayが判明しており、制御性T細胞を維持して、炎症と線維化を抑制することが判明しているが 2) ケルセチン、ダサニチブの併用療法、投与方法、投与量、投与期間の最適化を検証する。臨床応用へむけて、骨髄抑制の有無を確認する。2つの方法の老化細胞除去剤の有効性、毒性、副作用の有無、薬物動態をGVHDマウスモデルで検証する。両群に必要なマウス数は、骨髄移植の成功率が80％、薬剤投与の成功率が80％とすると各群に18匹ずつ必要である。( McNemar's test)。最適な投与時期、投与量、投与方法を検討し前臨床Proof ofconceptを得る。臨床応用へむけて倫理委員会申請準備とPMDA事前相談の準備をする。

Research Products

• [Journal Article] Eyelid blood vessel and meibomian gland changes in a sclerodermatous chronic GVHD mouse model. (2022)
  • Author(s): Yang F, Hayashi I, Sato S, Saijo-Ban Y, Yamane M, Fukui M, Shimizu E, He J, Shibata S, Mukai S, Asai K, Ogawa M, Lan Y, Zeng Q, Hirakata A, Tsubota K, Ogawa Y.
  • Journal Title: The Ocular Surface Volume: 26 Pages: 328-341
  • DOI: 10.1016/j.jtos.2021.10.006
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Multicenter prospective validation study for international chronic ocular graft-versus-host disease consensus diagnostic criteria. (2022)
  • Author(s): Ogawa Y, Dana R, Kim S, Jain S, Rosenblatt MI, Perez VL, Clayton JA, Alves M, Rocha EM, Amparo F, Seo KY, Wang Y, Shen J, Oh JY, Vanathi M, Nair S, Na KS, Riemens A, Sippel K, Soifer M, Wang S, Trindade M, Kim MK, Yoon CH, Yagi R, Hiratsuka R, Ogawa M, Shimizu E, Sato Y, Pflugfelder S, Tsubota K.
  • Journal Title: The Ocular Surface Volume: 26 Pages: 200-208
  • DOI: 10.1016/j.jtos.2022.09.002
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A single institute validation study comparing the international chronic ocular graft-versus-host disease consensus group diagnostic criteria with clinical parameters. (2022)
  • Author(s): Hiratsuka R, Shimizu E, Yamane M, Yazu H, Sato S, Fukui M, Mukai S, Uchino M, Kamoi M, Tatematsu Y, Saijo Y, Negishi K, Tsubota K, Ogawa Y.
  • Journal Title: The Ocular Surface Volume: 24 Pages: 12-14
  • DOI: 10.1016/j.jtos.2021.12.009
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cascade of inflammatory, fibrotic processes and stress-induced senescence in chronic GVHD-related dry eye disease. (2021)
  • Author(s): Ogawa Y, Kawakami Y, Tsubota K.
  • Journal Title: Int. J. Mol. Sci. Volume: 22 Issue: 11 Pages: 6114-6114
  • DOI: 10.3390/ijms22116114
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Autoimmune epithelitis and chronic inflammation in Sjogren’s syndrome-related dry eye disease. (2021)
  • Author(s): Ogawa Y, Takeuchi T, Tsubota K.
  • Journal Title: Int. J. Mol. Sci. Volume: 22 Issue: 21 Pages: 11820-11820
  • DOI: 10.3390/ijms222111820
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] National Institutes of Health Consensus Development Project on Criteria for Clinical Trials in Chronic Graft-versus-Host Disease: IIa. The 2020 Clinical Implementation and Early Diagnosis Working Group Report. (2021)
  • Author(s): Kitko CL, Pidala J, Schoemans HM, Lawitschka A, Flowers ME, G, SCowen EW, Tkaczyk E, Farhadfar N, Jain S, Steven P, Luo ZK, Ogawa Y, Stern M, Yanik GA, Cuvelier GDE, Cheng GS, Holtan Schultz KR, Martin PJ, Lee SJ, Pavletic SZ, Wolff D, Paczesny S, Blazar BR, Sarantopoulos S, Socie G, Greinix H, Cutler C:
  • Journal Title: Transplant Cell Ther Volume: 27 Issue: 7 Pages: 545-557
  • DOI: 10.1016/j.jtct.2021.03.033
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] National Institutes of Health Consensus Development Project on Criteria for Clinical Trials in Chronic Graft-versus-Host Disease: IV. The 2020 Highly morbid forms report. (2021)
  • Author(s): Wolff D,----Teshima T,-----, Jain S, Ogawa Y, Steven P, Luo ZK, Dietrich-Ntoukas T, Saban D, Bilic E, Penack O, Griffith LM, Cowden M, Martin PJ, Greinix HT, Sarantopoulos S, Socie G, Blazar BR, Pidala J, Kitko CL, Couriel DR, Cutler C, Schultz KR, Pavletic SZ, Lee SJ, Paczesny S.
  • Journal Title: Transplant Cell Ther Volume: 27 Issue: 10 Pages: 817-835
  • DOI: 10.1016/j.jtct.2021.06.001
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Update on ocular graft-versus-host disease. (2021)
  • Author(s): Nair S, Vanathi M, Mukhija R, Tandon R, Jain S, Ogawa Y.
  • Journal Title: Indian J Ophthalmol Volume: 69 Issue: 5 Pages: 1038-1050
  • DOI: 10.4103/ijo.ijo_2016_20
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Positive Effects of Oral Antibiotic Administration in Murine Chronic Graft-Versus-Host Disease. (2021)
  • Author(s): Sato S, Shimizu E, He J, Ogawa M, Asai K, Yazu H, Rusch R, Yamane M, Yang F, Fukuda S, Kawakami Y, Tsubota K, Ogawa Y.
  • Journal Title: Int J Mol Sci. Volume: 22 Issue: 7 Pages: 374-374
  • DOI: 10.3390/ijms22073745
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The Overlap Syndrome: A Case Report of Chronic Graft-Versus-Host Disease After the Development of a Pseudomembrane. (2021)
  • Author(s): Hayashi S, Shimizu E, Uchino M, Yazu H, Aketa N, Tsubota K, Ogawa Y
  • Journal Title: Cornea Volume: 40 Issue: 9 Pages: 1188-1192
  • DOI: 10.1097/ico.0000000000002593
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Observation of Chronic Graft-Versus-Host Disease Mouse Model Cornea with In Vivo Confocal Microscopy. (2021)
  • Author(s): Shimizu S, Sato S, Taniguchi H, Shimizu E, He J, Hayashi S, Negishi K, Ogawa Y, Shimmura S:
  • Journal Title: Diagnostics (Basel) Volume: 11 Issue: 8 Pages: 1515-1515
  • DOI: 10.3390/diagnostics11081515
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] MSCs Become Collagen-Type I Producing Cells with Different Phenotype in Allogeneic and Syngeneic Bone Marrow Transplantation. (2021)
  • Author(s): Rusch RM, Ogawa Y, Sato S, Morikawa S, Inagaki E, Shimizu E, Tsubota K, Shimmura S.
  • Journal Title: Int J Mol Sci Volume: 22 Issue: 9 Pages: 4895-4895
  • DOI: 10.3390/ijms22094895
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Special Interest Group. Advances in understanding of pathophysiology, diagnosis, and treatments of ocular graft-versus-host disease. (2022)
  • Author(s): Ogawa Y, Kim SK, Perez VL, Jain S, Steven P, Amparo F.
  • Organizer: ARVO 2022 Annual Meeting.
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Asia Cornea Joint symposium. Dry Eyes and Ocular Surface Disease. Ocular GVHD. (2022)
  • Author(s): Ogawa Y.
  • Organizer: The 8th World Cornea Congress.
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] インストラクションコース 難治性ドライアイに対する対策. (2022)
  • Author(s): 小川葉子, 山口昌彦, 細谷友雅, 猪俣武範, 内野美樹, 清水映輔, 佐藤真理.
  • Organizer: 第76回日本臨床眼科学会
• [Presentation] オキュラーサーフェス免疫研究の最前線. GVHDの免疫学的機序と新規治療法. (2021)
  • Author(s): 小川葉子
  • Organizer: 第125回日本眼科学会総会
  • Invited
• [Presentation] New-Perspective: Ocular Graft-versus-Host Disease is more than just another form of dry-eye disease. (2021)
  • Author(s): Steven P, Jain S, Ogawa Y, Luo Z, Victor P.
  • Organizer: The Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) 2021 Annual Meeting Virtual Meeting
  • Int'l Joint Research