自家移植を目指した機能性エクリン汗腺を含有する三次元培養表皮の開発

• Project/Area Number: 21K09769
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56070:Plastic and reconstructive surgery-related
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 亀田 健治 愛媛大学, 医学系研究科, 研究員 (60363264)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村上 正基 愛媛大学, 医学系研究科, 特任教授 (20278302) ; 森 秀樹 愛媛大学, 医学系研究科, 准教授 (60325389)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 三次元培養皮膚 / エクリン汗腺 / 再生医療 / 三次元培養 / エクリン汗管細胞 / 皮膚再生医療

Outline of Research at the Start

広範囲熱傷患者に対する分層植皮術を施行後、生着した植皮片に発毛が見られないこと、発汗が見られないことは医療提供者側には常識である。しかしながら患者からは、露出部において毛髪の有無に関しての苦情は少ないが、植皮部以外の残存する健常皮膚から大量に代償性発汗が生じて不快である、さらにエクリン汗には抗菌ペプチドのような重要な生体防御防御因子も含まれていることから、機能性エクリン汗腺が植皮片に含まれることは極めて望ましい。将来的に患者本人から採取したヒト角化細胞やエクリン汗腺細胞を培養し、自家移植を目指した三次元培養皮膚内に再生・機能させることができれば、次世代型の再生医療となりうると期待される。

Outline of Annual Research Achievements

皮膚再生医療を推進する目的のために、よりヒトに近い機能性三次元培養皮膚の作製は悲願である。我々はこれまでに羊膜を併用して三次元培養皮膚を作製することで、簡便に三次元培養皮膚を作製できる方法を確立し報告した。培養皮膚の作製法はここ数年である程度の確立を認め、熱傷などに対する保険適応治療として、ベンチャー企業などからも患者角化細胞を用いた培養表皮が供給されるようになり、これによる自家移植が可能となった。しかしながら機能面からみた場合、これら培養表皮は自家移植された植皮片には及ばない。今後マウスモデルに代わる実験モデルを目指す上で、三次元培養皮膚内で表皮及び真皮内に付属器を再現することのみならず、機能的な汗腺構造の再構築を可能とすることは、非常に重要な課題である。これまでの検討結果をさらに進化させ、三次元培養皮膚内で、機能性エクリン汗腺導管・腺房構造の構築を目指すことを主目的とする。
本研究の目的は、現在までに改良されてきた皮膚三次元培養表皮をさらに進化させ、機能性エクリン汗腺を含有する三次元培養皮膚の新規作成法を確立し、臨床応用を目指すことである。現在、ベンチャー企業などから供給される自家培養表皮には機能性エクリン腺あるいは毛包などは含まれていない。現時点では欠損部を被覆するための組織片の位置づけとなる自家培養表皮シートであるが、我々は、さらにエクリン汗腺の機能を有する次世代型の表皮シートあるいは自家培養皮膚の開発を目指す点において独自性・独創性がある。今回我々は、将来の基礎研究及び臨床応用に十分に貢献できる次世代型の三次元培養皮膚モデルの作製を目指すが、その結果を国内国外へ発信することで、あらたな基礎研究のプラットホームとして機能することのみならず、多数の皮膚疾患患者に対する臨床応用へ発展されていくことを強く切望する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

多指症患者様から得られた指尖部より、エクリン汗腺のorgan cultureを行った。すなわち、label retaining法及び免疫染色にて維持中に増殖した汗管、汗腺細胞を単離培養し、含有される幹細胞の同定・単離を行った。胎性幹細胞からの角化細胞への誘導についてはFAD培地にて培養し、その後BMPとアスコルビン酸添加することによりケラチン陽性細胞を誘導、さらに角化細胞用培地に変更し角化細胞の増殖を高め、継代することにより間葉系細胞の割合を減らしていく方法で、培養した。
表皮幹細胞が存在する基底層に多いK5陽性細胞の分離条件などを参考にして、表皮幹細胞マーカーMelanoma- associated chondroitin sulfate proteoglycan (MCSP)陽性細胞を単離する。分離後再増殖させた単離細胞内での多能性幹細胞（PSC）は、フローサイトメトリーによるTRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3、およびSSEA4をマーカーとしたソーティングにて同定・回収している。
しかし、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3、およびSSEA4のマーカーでのソーティング条件がまだ安定していない。今後、三次元構造形成及び分化について３Dイメージングを用いて確認をし、最適条件を探索したい。

Strategy for Future Research Activity

TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3、およびSSEA4のマーカーでのソーティング条件がまだ安定していない。
多指症患者から得られた指尖部より、エクリン汗腺のorgan cultureを行っているが、維持中に増殖した汗管、汗腺細胞を単離培養の最適条件を探索する。また、含有される幹細胞の同定・単離をlabel retaining法及び免疫染色にて行う。胎性幹細胞からの角化細胞への誘導についてはFAD培地にて培養し、その後BMPとアスコルビン酸添加することによりケラチン陽性細胞を誘導、さらに角化細胞用培地に変更し角化細胞の増殖を高め、継代することにより間葉系細胞の割合を減らしていく方法で、全経過として約1ヶ月以上を要する。表皮幹細胞が存在する基底層に多いK5陽性細胞の分離条件などを参考にして、表皮幹細胞マーカーMelanoma- associated chondroitin sulfate proteoglycan (MCSP)陽性細胞を単離する。分離後再増殖させた単離細胞内での多能性幹細胞（PSC）は、フローサイトメトリーによるTRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3、およびSSEA4をマーカーとしたソーティングにて同定・回収する。
その後、発育させた未熟なエクリン汗腺細胞から組織への分化誘導を行うために、ヒト角化細胞を用いた単層培養あるいは三次元培養表皮形成中にエクリン汗腺のスフェロイドを挿入し共培養を行い、正常皮膚同様に気相内での表皮内汗管形成誘導を行う。機能マーカー(各種ケラチン(K5, K14, K1, K10等)、involucrin, loricrin, TGase1等) を免疫染色し、三次元構造形成及び分化について３Dイメージングを用いて確認する。

Research Products

• [Journal Article] A fluorescence imaging technique suggests that sweat leakage in the epidermis contributes to the pathomechanism of palmoplantar pustulosis (2024)
  • Author(s): Kazuki Yatsuzuka , Ryosuke Kawakami , Yosuke Niko , Teruko Tsuda , Kenji Kameda , Nobushige Kohri , Satoshi Yoshida , Ken Shiraishi , Jun Muto , Hideki Mori , Yasuhiro Fujisawa , Takeshi Imamura , Masamoto Murakami
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 14(1) Issue: 1 Pages: 378-391
  • DOI: 10.1038/s41598-023-50875-x
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Highly concentrated trehalose induces prohealing senescence-like state in fibroblasts via CDKN1A/p21 (2023)
  • Author(s): Muto J, Fukuda S, Watanabe K, Dai X, Tsuda T, Kiyoi T, Kameda K, Kawakami R, Mori H, Shiraishi K, Murakami M, Imamura T, Higashiyama S, Fujisawa Y, Mizukami Y, Sayama K
  • Journal Title: Commun Biol. Volume: 6(1) Issue: 1 Pages: 1-18
  • DOI: 10.1038/s42003-022-04408-3
  • Peer Reviewed / Open Access