| Project/Area Number |
21K10261
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57080:Social dentistry-related
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| Research Institution | Ohu University |
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Principal Investigator |
今井 元 奥羽大学, 歯学部, 准教授 (90291343)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 礼子 奥羽大学, 歯学部, 准教授 (90333723)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | バルプロ酸 / 頭部神経堤 / 上皮間葉転換 / 頭部神経堤細胞 / Hoxa2 / Sox9 / 軸索伸長 / 顎顔面骨格 / 頭部神経堤細胞(NCC) / 第1第2鰓弓症候群(HFM) / バルプロ酸(VPA) / 原因不明の先天性奇形 / 第1第2鰓弓症候群 / 神経堤の脱上皮化 |
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| Outline of Research at the Start |
HFMは、第1第2鰓弓の発生異常により生じる先天性奇形(小下顎症や耳小骨欠損等)であり、歯科領域では唇顎口蓋裂に次いで多く、摂食障碍や伝音障碍を伴う症例も多い。しかし、その病因については、胎生期の鰓弓の血管形成の障害が有力視されているが、未だに不明である。本研究は、VPAにはヒストン脱アセチル化酵素(HDAC1)が関与する遺伝子の転写抑制に対する非特異的な阻害作用があり、VPAがin vitroの研究において、神経堤の脱上皮化EMTを阻害することに着目し、『妊娠初期の遺伝子転写に作用するVPA等の薬物の服用による頭部NCCの形成と移動の攪乱が、HFMの一因である』ことを証明する研究である。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、頭部神経堤（NC）形成直前のSDラット胚にバルプロ酸(VPA)を単回投与することによって、『① 頭部神経堤の上皮間葉転換(EMT)が、どのように阻害されるのか。② 頭部神経堤細胞(NCC)の移動経路が、どのように攪乱されるのか。③脳神経の軸索ガイダンス因子(Sema3)が、どのように攪乱されるのか。④脳神経ニューロンの軸索伸長が、どのように攪乱されるのか。⑤ 顎顔面骨格に、どのような奇形を生じるのか。』などの解明を作業目標としている。①-④に関しては、①VPA投与により中脳-ロンボメア（R）1/2 NCにおいてHoxa2 mRNAの異所性発現とSox9 mRNAの発現の減少が検出され、EMTが阻害されていた。 さらに、②SNAI2陽性NCCの形成と移動が減少し、全胚培養系を用いたDiI標識細胞の追跡実験においても、中脳-R1/2 NCCは前頭鼻隆起（FNM）や第1鰓弓（Ba1）への移動が減少し、代償性にR4 NCCがFNMやBa1に移動していた。さらに、③Sema3の発現異常 と④三叉神経の軸索伸長の抑制が観察された。これらの結果は、頭部NC形成直前のVPAの単回投与は、中脳-R1/2のNCにおけるHoxa2、Sox9の発現異常を介して、中脳-R1/2のNCCの減少とR4のNCCの移動異常が起されることを示しており、これらの異常によって、三叉神経の軸索伸長の抑制が引き起されることを示唆していた。現在、上記の⑤の『上顎・下顎・舌骨・耳小骨などに、どのような奇形を生じるのか。』を解明するために、排卵時刻に個体差が殆ど生じないWistar-Imamichi (WI)ラットに系統を変え、頭部神経堤（NC）形成直前のWIラット胚にVPAを単回投与し、頭部NCCの形成と移動の撹乱した胚を胎齢12.5日、及び、20日で摘出し、顎顔面の原基と骨格の形態計測と解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
移動中の頭部神経堤細胞(CNCC)の有用なマーカーとして用いることができ、さらに、神経細胞やグリア細胞への分化運命の定まったCNCCのマーカーとしても有用であるSox10のホールマウント in situ ハイブリダイゼーション用mRNAプローブの作製に手間取ったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
作業目標①-④に関しては、既に、頭部神経堤（NC）形成直前のWistar-Imamichi (WI)ラット胚にVPA/salineを投与し、E9.5-E11.5の胎仔を摘出し、Hoxa2(後方化因子),Sox9(NCCのEMT因子),Sox10(EMT直後のNCCマーカー)のin situ ハイブリダイゼーション(WISH)を行っている。さらに、同様に薬物投与したE12.5の胎仔を摘出し、Sox10 WISHの結果に基づいて、成熟ニューロンマーカーの抗neurofilament抗体、あるいは、未熟ニューロンマーカーの抗β tubulin III 抗体を用いたE12ラット胚のホールマウント免疫染色 (WIHC)標本の詳細な観察を実施する予定である。
作業目標⑤の『上顎・下顎・舌骨・耳小骨の形成が、どのように攪乱されるのか。』に関しては、同様にVPAを投与したE12.5(軟骨形成の初期マーカー)のWIラット胎仔を摘出し、形態計測を行っており、顔面原基の形態計測と統計解析を行う。頭部NCCの形成と移動の撹乱を行った胚を妊娠20日目に摘出し、また、アルシアンブルー-アリザリンレッド染色をした透明化骨格標本を作成し、これらのサンプルの解析を進めている最中である。
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