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Mechanisms of cytotoxicity due to the generation and accumulation of toxic advanced glycation end-prodcuts (TAGE) in cardiomyocytes

Research Project

Project/Area Number 21K11607
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 59040:Nutrition science and health science-related
Research InstitutionKanazawa Medical University

Principal Investigator

高田 尊信  金沢医科大学, 総合医学研究所, 講師 (20515308)

Project Period (FY) 2021-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Keywords終末糖化産物 / 心筋細胞 / Crude AGE pattern / Diverse AGE pattern / Multiple AGE pattern / 質量分析 / 1アミノ酸残基結合型 / 2アミノ酸残基結合型 / Heat shock protein 90 / オートファジー / LC3 / 心臓線維芽細胞 / 子宮頸癌細胞 / GFP / 毒性終末糖化産物 / 膵島β細胞 / LC-3 / p62 / 生活習慣病 / 心疾患
Outline of Research at the Start

これまでに、砂糖や果糖ブドウ糖液糖(HFCS)等の過剰摂取により、糖代謝中間体のグリセルアルデヒドと蛋白質の反応物である「毒性終末糖化産物(toxic AGEs, TAGE)」が、心筋細胞に生成・蓄積すると、オートファジー誘導蛋白質LC3-II/LC3-Iの比率が低下し、拍動低下と細胞死を引き起こすことを明らかにした。
本研究では、1)TAGEを分解するはずのオートファジー機構を、TAGEが阻害する可能性、2)TAGEを蓄積した細胞から逸脱/漏出した細胞外TAGEが、受容体を介して細胞障害を起こす可能性、3)動物実験により、HFCSの摂取による心臓・血中TAGE量の増加/心臓障害を解析する。

Outline of Annual Research Achievements

心筋細胞にグリセルアルデヒドを添加することにより、拍動低下と細胞死が引き起こされることをすでに報告している。これらの現象がグリセルアルデヒドの添加により引き起こされることを証明するために、カルボニルトラップ原理で、グリセルアルデヒドあるいはその誘導体と結合する性質をもつ、アミノグアニジン前処理を行い、グリセルアルデヒド添加を行っても、拍動低下と細胞死のいずれも起きないことを明らかにした。前年度において、心筋細胞に対するグリセルアルデヒド添加により、Heart shock protein (HSP) 90-betaにおいて、高分子化したHSP90-betaが観察された。Western blot解析により分子量210 kDa前後であることは明らかとなったが、その機序は不明である。しかし、試料を変性させて、Western blot解析していることから、ジスルフィド結合ではない、共有結合によりHSP90-betaが、ホモ二量体あるいは他のタンパク質と架橋構造をもった可能性が高い。この架橋構造は、グリセルアルデヒド誘導体に由来する低分子化合物により形成された可能性は高い。2023年度当初は、この解析を質量分析を中心に行う予定であった。しかし、研究代表者は、グリセルアルデヒドに由来するAGEsへの研究アプローチを大きく変えた。1種の糖代謝副産物(例:グリセルアルデヒド)から多種多様なAGEsが生成しうる点、糖代謝副産物とタンパク質の修飾の組み合わせの複雑さを、Crude AGE pattern、Type 1 Diverse AGE pattern、 Type 2 AGE pattern、Type 1 Multiple AGE pattern、Type 2 Multiple AGE patternとして分類し、これに基づいて、改めて質量分析を用いた解析のための、準備を行った。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

従来の着想では、心筋細胞にグリセルアルデヒドを添加したときに、Toxci AGEsと命名されたAGEs(TAGE。構造は、2024年4月現在でも不明)が生成する点にのみ着目し、心筋細胞に生じる現象とTAGEの生成にちての相関にみから、現象を解釈しようとしていた。しかしながら、実際には、膵管上皮細胞を用いた実験によって、グリセアルアルデヒドからは、少なくとも「TAGEではないAGEs」が3種類(MG-H1, GPAP, Argpyrimidihe)も生成することが証明されており(Lakmini Senavirathna et al. Cells 10(5):1005, 2021)、自らの研究計画に修正が必要であると考えた。研究代表者は、TAGEが「2アミノ酸残基結合型」の構造をしていると推測していた。
しかし、仮にTAGEがHSP90-betaに修飾していたとしても、その修飾が「分子間結合」のみであるとは考え難く、むしろ「分子内結合」と同時に進行している可能性が高い。また、HSP90-betaを含め、特定のタンパク質に対してTAGEのみが修飾するということは考えにくく、むしろ、他の種類のAGEsの結合が起こりえるなかで、多種多様なAGEs構造が胸像している可能性が高い(Takanobu Takata et al. Metabolites 14(1): 3, 2024)。
この着想のもと、次年度は、TAGEの生成量あるいは特定のTAGE以外のAGEs修飾の可能性を抗体や質量分析により解析する。
すでにグリセルアルデヒドから生成することが証明されたMG-H1、GLAP、Argpyrimidineは「1アミノ酸残基結合型」であるので、分子間あるいは分子内結合には寄与しないが、分子内結合をしている可能性を、次年度において、抗体および質量分析を用いて、証明する。

Strategy for Future Research Activity

(1)質量分析により、HSP90-betaに結合した「1アミノ酸残基結合型」のAGEsの種類(例:MG-H1, CEL, Argpyrimidineなど)を同定する。AGEs修飾を受けたペプチドを解析することにより、研究代表者が令和5年度において論文発表した、「AGEsの修飾パターンの分類方法(Crude AGE pattern, Type 1 AGE pattern, Type 2 AGE pattern, Type 1 Multiple AGE pattern)」に基づき、心筋細胞内の拍動や細胞死に関連するタンパク質に、様々なAGEs修飾に生じていることを証明する。(2)架橋構造部位を同定するため、アブカムの抗HSP90抗体と抗HSP90-beta抗体の結合部位を調査し、その情報をもとに、当該アミノ酸配列に標的をしぼって、現在、知られている「2アミノ酸残基結合型」のAGEsの構造を、質量分析解析ソフトのデータベースに入力した上で、質量分析を行う。これにより、実際に架橋を形成しているAGEsを同定する。これにより、研究代表者が提唱したType 2 Multiple patternの存在を証明する。
(3)心筋細胞内に様々な種類のAGEsが生成・蓄積する現象が、オートファジー阻害と関連があることを証明するために、LC3の制御に関わるAtg7とBeclin-1の発現をタンパク質レベルで解析する。これにより、現在、グリセルアルデヒド添加した心筋細胞で観測されるLC3の減少が、「オートファジー過剰亢進」の結果生じたものではなく、「オートファジー阻害」によるものであることの証明とする。

Report

(3 results)
  • 2023 Research-status Report
  • 2022 Research-status Report
  • 2021 Research-status Report
  • Research Products

    (21 results)

All 2024 2023 2022 2021 Other

All Journal Article (10 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 10 results,  Open Access: 10 results) Presentation (8 results) Remarks (3 results)

  • [Journal Article] Analysis of Crude, Diverse, and Multiple Advanced Glycation End-Product Patterns May Be Important and Beneficial2024

    • Author(s)
      Takanobu Takata, Togen Masauji, Yoshiharu Motoo
    • Journal Title

      Metabolites

      Volume: 14 Issue: 1 Pages: 3-3

    • DOI

      10.3390/metabo14010003

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Is the Novel Slot Blot a Useful Method for Quantification of Intracellular Advanced Glycation End-Products?2023

    • Author(s)
      Takanobu Takata
    • Journal Title

      Metabolites

      Volume: 13 Issue: 4 Pages: 564-564

    • DOI

      10.3390/metabo13040564

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    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Novel In Vitro Assay of the Effects of Kampo Medicines against Intra/Extracellular Advanced Glycation End-Products in Oral, Esophageal, and Gastric Epithelial Cells2023

    • Author(s)
      Takanobu Takata, Yoshiharu Motoo
    • Journal Title

      Metabolites

      Volume: 13 Issue: 7 Pages: 878-878

    • DOI

      10.3390/metabo13070878

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      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Potential of the Novel Slot Blot Method with a PVDF Membrane for Protein Identification and Quantification in Kampo Medicines2023

    • Author(s)
      Takanobu Takata, Togen Masauji, Yoshiharu Motoo
    • Journal Title

      Membranes (Basel)

      Volume: 13 Issue: 12 Pages: 896-896

    • DOI

      10.3390/membranes13120896

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      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Intracellular Toxic Advanced Glycation End-Products May Induce Cell Death and Suppress Cardiac Fibroblasts2022

    • Author(s)
      Takata Takanobu、Sakasai-Sakai Akiko、Takeuchi Masayoshi
    • Journal Title

      Metabolites

      Volume: 12 Issue: 7 Pages: 615-615

    • DOI

      10.3390/metabo12070615

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      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Effects of Toxic AGEs (TAGE) on Human Health2022

    • Author(s)
      Takeuchi Masayoshi、Sakasai-Sakai Akiko、Takata Takanobu、Takino Jun-ichi、Koriyama Yoshiki
    • Journal Title

      Cells

      Volume: 11 Issue: 14 Pages: 2178-2178

    • DOI

      10.3390/cells11142178

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    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] The Association between Accumulation of Toxic Advanced Glycation End-Products and Cytotoxic Effect in MC3T3-E1 Cells2022

    • Author(s)
      Sakasai-Sakai Akiko、Takata Takanobu、Takeuchi Masayoshi
    • Journal Title

      Nutrients

      Volume: 14 Issue: 5 Pages: 990-990

    • DOI

      10.3390/nu14050990

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      2021 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Intracellular Toxic Advanced Glycation End-Products in 1.4E7 Cell Line Induce Death with Reduction of Microtubule-Associated Protein 1 Light Chain 3 and p622022

    • Author(s)
      Takata Takanobu、Sakasai-Sakai Akiko、Takeuchi Masayoshi
    • Journal Title

      Nutrients

      Volume: 14 Issue: 2 Pages: 332-332

    • DOI

      10.3390/nu14020332

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      2021 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Accumulation of Toxic Advanced Glycation End-Products Induces Cytotoxicity and Inflammation in Hepatocyte-Like Cells Differentiated from Human Induced Pluripotent Stem Cells2021

    • Author(s)
      Kikuchi Chigusa、Sakasai-Sakai Akiko、Okimura Risa、Tanaka Hinako、Takata Takanobu、Takeuchi Masayoshi、Matsunaga Tamihide
    • Journal Title

      Biological and Pharmaceutical Bulletin

      Volume: 44 Issue: 10 Pages: 1399-1402

    • DOI

      10.1248/bpb.b21-00520

    • NAID

      130008095843

    • ISSN
      0918-6158, 1347-5215
    • Year and Date
      2021-10-01
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      2021 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Comprehensive analysis of protein-expression changes specific to immunoglobulin G4-related disease2021

    • Author(s)
      Kawanami Takafumi、Kawanami-Iwao Haruka、Takata Takanobu、Ishigaki Yasuhito、Tomosugi Naohisa、Takegami Tsutomu、Yanagisawa Hiroto、Fujimoto Shino、Sakai Tomoyuki、Fujita Yoshimasa、Yamada Kazunori、Mizuta Shuichi、Kawabata Hiroshi、Fukushima Toshihiro、Hirose Yuko、Masaki Yasufumi
    • Journal Title

      Clinica Chimica Acta

      Volume: 523 Pages: 45-57

    • DOI

      10.1016/j.cca.2021.08.025

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    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] 心筋細胞の拍動低下および細胞死に関与するHeat Shock Protein 90 betaの糖化~グリセルアルデヒド誘導体化HSP90 betaの生成2023

    • Author(s)
      高田尊信
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      第23回日本蛋白質科学会年会
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    • Author(s)
      高田尊信
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      高田尊信、逆井(坂井)亜紀子、竹内正義
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      第70回日本心臓病学会学術集会
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      竹内正義、逆井(坂井)亜紀子、高田尊信、瀧野純一、郡山恵樹、古川絢子、那須隆斗、菊池千草、長嶺憲太郎、堀隆光、松永民秀
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      日本薬学会第142年会
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      逆井(坂井)亜紀子、高田尊信、竹内正義
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      第44回日本分子生物学会年会
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      逆井(坂井)亜紀子、高田尊信、瀧野純一、竹内正義
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      高田尊信、逆井(坂井)亜紀子、瀧野純一、竹内正義
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      第64回日本糖尿病学会年次学術集会
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      https://www.kanazawa-med.ac.jp/laboratories/mri-cellular-biology.html

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  • [Remarks] 金沢医科大学総合医学研究所 高田尊信

    • URL

      http://nkrims.kanazawa-med.ac.jp/profile/ja.aec128bc370cac94bc00dc5b96c96d94.html

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    • URL

      https://researchmap.jp/read0139363

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Published: 2021-04-28   Modified: 2024-12-25  

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