| Project/Area Number |
21K12220
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 63010:Environmental dynamic analysis-related
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
藤原 健智 静岡大学, 創造科学技術大学院, 教授 (80209121)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 従属栄養硝化 / POD / ピルビン酸オキシム酸素添加酵素 |
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| Outline of Research at the Start |
従属栄養微生物による環境中の硝化作用への寄与は、独立栄養性の硝化菌と同等、あるいはそれ以上に大きいと考えられている。独立栄養硝化がエネルギー産生と共役する異化的作用であるのに対し、従属栄養硝化のプロセスはエネルギーの消費しかもたらさない。従属栄養硝化を行うことが微生物自身にとってどのようなメリットがあるのか？、という根本的な問いに答え得る仮説を検証することで、従属栄養硝化に関する微生物生態学やその応用研究を発展させるために必要となる、明確な生化学的基盤を与える。さらにその仮説に基づいて農薬を用いない硝化抑制の可能性についても検討する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
① Alcaligenes faecalis由来のピルビン酸オキシム酸素添加酵素（AfPOD）、活性に必須であるN末端18アミノ酸残基を欠損させた変異AfPOD、およびBradyrhizobium sp. WSM3983由来のPODそれぞれの結晶構造解析についての学術論文を作成中である。
② アミノ酸配列に基づく分子系統解析、および機能分析の結果、PODはクラスⅡアルドラーゼ・スーパーファミリーに属する他の酵素タンパク質とは明確に区別される単系統群を構成することを示した。またPOD遺伝子は、芳香族化合物の代謝や輸送に関与すると考えられる遺伝子と同一の転写単位を構成していることから、PODが、従属栄養硝化とともに何らかの、おそらく芳香族化合物の代謝にも関与する‘ダブルファンクション’酵素である可能性を提起した。この仮説に関する学術論文がオランダ微生物学会の発行するAntonie van Leeuwenhoek誌に掲載された。
③ 前年度のA. faecalisのPOD遺伝子変異株の作成に引きつづいて、PODのホモログであるPOD2の遺伝子変異株、さらにPODとPOD2の二重変異株を作成した。これによって、比較メタボロム解析によるPODの「真」の生理的機能の解明に向けた準備が整った。
④ 従属栄養硝化能を持たない放線菌Streptomyces rubrolavendulaeのPOD遺伝子破壊を行い、得られた変異株が「気菌糸形成の促進」という特異な表現型を示すことを見出した（2021年学会発表）。この結果は、②で述べた、PODが従属栄養硝化への関与だけでなく、何らかの別の機能を併せ持っている可能性を支持する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
活性型である二価鉄結合状態のAfPODの結晶構造が高分解能で得られ、活性中心の構造を明らかにすることはできたものの、基質（ピルビン酸オキシム）あるいは阻害剤（ピコリン酸）の結合状態の構造がまだ得られていないため、強い根拠に基づいて反応機構を詳細に議論することは現状では難しい。また、2022年度に行ったPOD遺伝子破壊とメタボロム解析に引き続き、2023年度（最終年度）はPOD2遺伝子変異株とPOD・POD2二重変異株を作成し、親株と合わせ4種の株間での比較メタボロム解析によってPODの「真」の機能を解明する準備を整えた。しかし分析条件の最適化等に手間取り、メタボロム解析に着手できなかったため、必要経費の繰越しを申請することとなった。以上を総合し、最終年度の進捗状況は「おおむね順調」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究実績の概要として挙げた①～④のうち、最終年度に論文発表に至らなかった①、準備までは整えたが分析に至らなかった③、および④に関連した研究を今後進めて行く。まずPODの結晶構造に関する論文を作成し投稿する（①）。新たに採択された科学研究費（令和6~8年度基盤研究(C)：24K15258、「従属栄養硝化の真の生理的意義の解明とその展開」）でオープンジャーナルへの投稿費用を賄う。またPODが関与する代謝経路の分析のため最終年度に作成した3種の変異株を用いてメタボロム解析を行う（②）。その費用として最終年度からの繰り越し予算を用いる。また、放線菌におけるPODの機能解明（④）を新たに採択された科学研究費を用いて進める。すでに作成済みのS. rubrolavendulaeのPOD変異株のオミックス解析を計画している。親株との比較オミックス解析によって、POD遺伝子変異がどのようなメカニズムで気菌糸形成の促進をもたらすかを明らかにする。
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