| Project/Area Number |
21K12236
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 63020:Radiation influence-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
尾田 正二 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 准教授 (50266714)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
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| Keywords | 精子形成 / メダカ / 減数分裂 / 精原細胞 / 精巣卵 / p53 / 放射線 / rev1 / 低線量放射線被ばく / 低線量率放射線被ばく / ガンマ線 / トランスクリプトーム / 低線量率被ばく / 精子 / トランスクリプトーム解析 |
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| Outline of Research at the Start |
低線量（率）慢性被ばくの生物影響が生態系に与えるインパクトの評価のためには、動物自体が備える修復機能によってマスクされ潜在化されているリスクの評価が不可欠である。動物の精子機能は放射能感受性が最も高く、精子機能のダメージは長期の時間軸では生態系の不安定化をもたらすリスクともなる。本研究ではDNA修復関連遺伝子（rev1）を欠損するメダカにおける精原細胞の異常分化（精巣卵）を指標として、低線量（率）慢性被ばくが脊椎動物の精子機能に与えている潜在的インパクトを可視化し、そのリスクを評価する。また、精巣卵が放射線によって誘導されるメカニズムを解明し、生殖細胞の雄性化の分子メカニズムの解明に迫る。
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| Outline of Annual Research Achievements |
損傷乗り越え複製において機能する rev1 遺伝子を欠損するメダカ精巣において、ガンマ線照射により多数の精巣卵が誘導される。p53遺伝子を欠損するメダカ精巣においてもガンマ線照射が精巣卵を誘導することから、放射線によって引き起こされたDNA損傷が精原細胞を卵原細胞に誤分化させる可能性が考えられた。本研究課題では、メダカ精巣卵誘導における rev1 の関与を明らかにすることにより、ガンマ線による精巣卵誘導と精原細胞のアイデンティティ維持の分子機構の解明を目的としている。また、p53遺伝子を欠損するメダカ精巣におけるガンマ線照射には線量率効果がなく、低線量率被ばくがより効果的に精巣卵を誘導する。rev1遺伝子の欠損がどのようにして精原細胞の精巣卵への誤分化を引き起こすかを明らかにできれば、放射線による精巣卵誘導が線量率効果を示さない理由が明らかになり、低線量率被ばくによる生物影響の評価において有用な知見を得ることができるものと期待できる。
当初は精巣での RNA-seq 解析を実施する計画であったが、コロナ禍の間に進めたメダカ精巣の単細胞レベル RNA-seq （single cell RNA-seq; scRNA-seq） データの解析の結果、放射線による精原細胞の精巣卵への誤分化にrev1 遺伝子が関与していないことが明らかとなった。さらに、精巣組織レベルでの RNA-seq 解析では十分に有用な情報を得られないことも判明した。一方、多くの精原細胞を含むメダカの精巣scRNA-seq データにおいて精子形成プロセスでの遺伝子発現変化を詳細に解析することが可能であり、脊椎動物の精子形成を遺伝子レベルで詳細に解析する上での有用なプラットホームとなり得る。本研究課題は今後scRNA-seqデータの解析に集中し、メダカの精子形成の分子機構の全容の解明を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
京都大学放射線生物研究センターの低線量長期放射線照射装置を共同利用してrev1 欠損メダカへの低線量率ガンマ線（100 mGy in 1 week）照射実験を計画したがコロナ禍のため令和２，３年度に実施できなかった。その間、別途取得していたp53欠損メダカ精巣の単細胞レベル RNA-seq （single cell RNA-seq; scRNA-seq） データの解析を実施した結果、放射線による精原細胞の精巣卵への誤分化にrev1 遺伝子が関与していないことが明らかとなった。p53遺伝子の欠損、放射線の被ばくに関係なくHd-rR系統のメダカ精巣では恒常的に精原幹細胞であるA型精原細胞の一部が卵原細胞に誤分化しており、p53依存性アポトーシスで排除されていることが示唆された。rev1 遺伝子も誤分化した精巣卵の排除に寄与していると考えられる。放射線の被ばくにより減数分裂と精子完成が促進されると卵原細胞化した精原細胞の卵としての分化も促進され、成長し大型化した卵原細胞が精巣卵として組織学的に認められるに至ったものと考えられる。一方、p53遺伝子を欠損するメダカでは卵原細胞に誤分化したA型精原細胞がアポトーシスによって排除されないために、放射線照射によりあたかも多数の精巣卵が新規に誘導される組織像となったと解釈される。
一方、scRNA-seq解析が可能とした精子形成のプロセスにおける各細胞の遺伝子発現のプロファイリングは、通常の RNA-seq 解析では精子形成における放射線被ばくのインパクトを評価するために有用な情報を得ることは望めないことも明らかにした。rev1 遺伝子欠損メダカを対象としたこれ以上の研究は無用であることから中止し、令和６年度はHd-rR系統メダカおよびp53欠損メダカの精巣 scRNA-seqデータの解析をさらに進め、精子形成の分子機構の解明に集中する。
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| Strategy for Future Research Activity |
A型精原細胞より分化したB型精原細胞において、増殖因子の一つである myc を発現するB型精原細胞は体細胞分裂による増殖を継続し、myc を発現しないB型精原細胞が体細胞分裂を停止して減数分裂に移行していることを見出している。また、精子形成において広範囲に大規模にDNAのメチル化をはじめとするエピジェネティッ制御が起こっていることを見出した。これらの知見は、メダカ精巣のscRNA-seq データの解析により脊椎動物の精子形成における重要な疑問を解明できることを示しており、令和６年度はHd-rR系統メダカおよびp53欠損メダカの精巣 scRNA-seqデータの解析をさらに深化させ、これらの解析にチャレンジする。特に、クラスター内の細胞（RNA-seqデータ）を遺伝子の発現の有無によりさらに細かくクラスタリングし、精子形成に伴うそれら細胞における遺伝子発現パターンの変化を細かく追跡することにより、細胞の分化プロセスにおけるエピジェネティック制御がいかになされるのか、その変化と精子形成の進捗がどう連動するのか、精子形成の分子機構の全容を解明できると期待する。
scRNA-seq解析を実施するために温存しておいた研究予算は投稿論文をオープンアクセス化するために支出する。解析対象となるscRNA-seq データは既に取得済みであり、解析に使用するパソコンも既に取得して稼働している。オープンリソースである R を主に使用してscRNA-seq データの解析を行うため、ソフトウェアの取得費用も不要であり、追加の経費は発生しない。
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