化学物質による自閉症発症のリスク評価：SHANK3のエピジェネティック変異解析

• Project/Area Number: 21K12277
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 64010:Environmental load and risk assessment-related
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 新井 良和 宮崎大学, 農学部, 助教 (90614769)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: エピジェネティクス / DNAメチル化 / 自閉症 / 環境化学物質 / 神経分化 / 化学物質 / 自閉スペクトラム症

Outline of Research at the Start

自閉スペクトラム症(自閉症)は近年子どもで増加する神経疾患である。SHANK3遺伝子変異は発症要因の1つであり、SHANK3にヘテロ接合型変異をもつ場合、正常タンパク質量の低下が疾患発症に関与する。しかし、同一家族内でも発症の有無に個人差があり、何がSHANK3発現量に影響して疾患発症を左右するのか、未だ不明である。本申請では、妊娠期の母体環境中に存在する有害な化学物質が、疾患発症における神経分化異常に関与する、という仮説のもと、SHANK3ヘテロ欠損ヒトiPS細胞の神経分化系を用いて、化学物質による神経分化異常を遺伝子の発現調整機構であるエピジェネティクスで解明する。

Outline of Annual Research Achievements

自閉スペクトラム症(自閉症)は近年子どもで増加する神経疾患である。自閉症の原因遺伝子の1つとしてSHANK3が報告されており、SHANK3遺伝子にヘテロ接合型変異をもつ場合、正常タンパク質量の低下が疾患発症に関与することが知られている。しかし、同一変異を有する家系内でも発症の有無や重篤度に個人差があり、何がSHANK3の遺伝子発現に影響して疾患発症に寄与するのか、その分子メカニズムは不明である。本研究では妊娠期の母体環境中に存在する有害な化学物質が、エピジェネティック変異原としてSHANK3の遺伝子発現制御を乱し、疾患発症における神経分化異常に関与する、という仮説のもと、SHANK3ヘテロ欠損ヒトiPS細胞の神経分化系を用いて、化学物質による神経分化異常を解明する。
令和4年度は昨年度に引き続き、CRISPR/Cas9によるゲノム編集を用いたSHANK3ヘテロ欠損ヒトiPS細胞株の樹立を進めた。これまでに自閉症患者で認められたSHANK3の遺伝子変異を参考に、特に重要な2ヶ所のエクソンにおける変異を採用し、計10株のSHANK3ヘテロ欠損ヒトiPS細胞株の樹立に成功した。さらに、樹立したヘテロ欠損ヒトiPS細胞の神経幹細胞への分化能を解析した結果、同一遺伝子変異を有するにも関わらず、樹立したiPS細胞は細胞株ごとに神経幹細胞への分化能が大きく異なっていた。以上より、令和4年度までに、DNAメチル化にもとづくSHANK3の遺伝子発現調節機構の解析、および目的とするSHANK3ヘテロ欠損ヒトiPS細胞株の取得が完了し、化学物質による神経分化異常を解明するための準備が整った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和3年度までに、CRISPER/Cas9を用いたゲノム編集によって、SHANK3の複数あるスプライシングバリアントのうち、SHANK3aのみ、およびすべてのSHANK3バリアントが分解されるヒトiPS細胞株を作製した。令和4年度ではさらに、得られたSHANK3変異細胞株についてシングルセルクローニングを行い、DNAシークエンスによる塩基配列決定をもとに目的とするSHANK3ヘテロ欠損ヒトiPS細胞株を選別した。解析の結果、計10株のSHANK3ヘテロ欠損ヒトiPS細胞株の樹立に成功した。続いて、樹立したSHANK3ヘテロ欠損ヒトiPS細胞株の神経細胞系への分化能を検証するために、まずはじめにiPS細胞から神経幹細胞への体外での分化能を解析した。SHANK3ヘテロ欠損ヒトiPS細胞株の神経幹細胞への分化能は細胞株ごとに大きく異なり、一部の細胞株では神経幹細胞への分化能が他の株に比べて大きく低下するものが認められた。以上より、本年度までの研究によって、SHANK3の遺伝子発現調節機構の解析、および使用するSHANK3ヘテロ欠損iPS細胞株の取得が完了し、化学物質による神経分化異常を解明するための準備が整った。

Strategy for Future Research Activity

令和4年度までにゲノム編集で作製したSHANK3ヘテロ欠損ヒトiPS細胞について、体外で神経細胞への分化誘導を行い、SHANK3遺伝子発現レベルと神経細胞への分化能との関係性を解析していく。さらに、令和4年度までに明らかとなった、SHANK3遺伝子発現を乱す5種類の化学物質をSHANK3ヘテロ欠損ヒトiPS細胞に暴露して、遺伝子変異と環境要因の相互作用に伴う神経細胞分化への影響を検証していく。同時に、エピジェネティクスを介したSHANK3の遺伝子発現制御機構について、プロモーターアッセイやバイサルファイトシークエンスを用いた詳細な解析で明らかにする。以上によって、化学物質による神経分化異常について、SHANK3ヘテロ欠損ヒトiPS細胞でのSHANK3のエピジェネティック制御機構をもとに解明していく。