ペスチウイルスの宿主域拡大戦略の解明

• Project/Area Number: 21K14978
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 42020:Veterinary medical science-related
• Research Institution: Nippon Veterinary and Life Science University
• Principal Investigator: 塩川 舞 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 講師 (00739162)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 牛ウイルス性下痢ウイルス / ボーダー病ウイルス / ペスチウイルス / BVDV / BDV / 宿主特異性 / 馴化 / 盲継代 / 細胞指向性 / 豚熱ウイルス

Outline of Research at the Start

ウイルス感染症を制御するためには対象ウイルスの宿主域を把握しておくことが必須である。フラビウイルス科ペスチウイルス属には宿主域の狭い豚熱ウイルスと宿主域の広い牛ウイルス性下痢ウイルスとボーダー病ウイルスが属する。これらのウイルスは多くの共通性状を有するにも関わらず宿主域が異なる。さらに、各ウイルスの宿主域が一部重なることによって検査上の混乱を招き、疫対対策が困難になっている。本研究では、これら同属の３種のウイルスを用いてペスチウイルスの宿主域を規定する遺伝学的な要因を同定し、ペスチウイルスの宿主域拡大戦略を解明することを目的とする。これにより、豚熱を含むペスチウイルス感染症の防疫に貢献する。

Outline of Annual Research Achievements

研究計画3年目は、2年目に作出した異種動物由来細胞馴化ペスチウイルス（P10またはP20）の全長遺伝子配列を次世代シーケンス解析によって決定することを計画している。自然宿主以外の動物由来細胞に馴化したP10およびP20ウイルスの力価測定はすでに完了している。また、変異の変遷や蓄積も明らかにするため、P20だけでなく、P10等の馴化過程の試料も解析に加える予定としており、次世代シーケンス解析による全長塩基配列の決定には、以下のウイルスを用いることとした。
BVDV/MDBK細胞（牛）、BVDV/iBE-1細胞（牛）、BVDV/MDOK細胞（羊）、BVDV/CRFK細胞（猫）
BDV/CPK細胞（豚）、BDV/MDBK細胞（牛）、BDV/iBE-1細胞（牛)、BDV/iRKp細胞（ウサギ）、BDV/CRFK細胞（猫）、BDV/fcwf4細胞（猫）
上記馴化ウイルスの全長塩基配列およびアミノ酸配列を確定し、馴化前（P0）のウイルスと比較することで、異種動物由来細胞への馴化（＝異なる宿主への感染性）にかかわる遺伝子およびアミノ酸領域を特定する。
また、変異の意義を解析するために必要なウイルスを人工合成するセルフリーシステムの構築も3年目に実施している。CPER法を採用することとし、まずは、BVDVおよびBDVの全長遺伝子を複数の断片に分けて増幅し、クローニングベクターに組み込む作業を行った。各ベクターからウイルスの遺伝子断片を増幅し、CPER法により連結・増幅したのちに、細胞へ導入し、ウイルスが作出されるかどうか試みた。その結果、BVDVをCPER法によって作出することができた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ウイルスを人工合成するために使用していたキットが製造中止となり、別のキット／方法に変更する必要があった。CPER法を採用することとしたが、その確立に予想よりも時間を要している。
BVDVはCPER法によってウイルス合成できたが、BDVの塩基配列の一部にクローニング困難な領域があり、クローニングの段階でやや難航している。この問題を打開する目途はたっているものの「やや遅れている」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

異種動物由来細胞に馴化したBVDVとBDVのウイルス力価は10^4～10^7 TCID50/mL程度であることがわかっており、その容量も十分に保存できているため、次世代シーケンス解析にすぐに使用できる状況である。P10またはP20ウイルスの全長塩基配列からアミノ酸配列を確定できたら馴化前（P0）のそれと比較することで、馴化や宿主域の決定にかかわるアミノ酸変異を特定する。細胞への侵入やウイルスRNAの複製に関与するウイルス蛋白質領域の変異を優先的に解析することとし、順次変異ウイルスを作出する。変異ウイルスの感染性を培養細胞レベルで評価・検討し、その違いから感受性宿主域の決定に関与する遺伝子／アミノ酸領域を特定することを目指す。