| Project/Area Number |
21K15005
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 42040:Laboratory animal science-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
藤原 靖浩 東京大学, 定量生命科学研究所, 助教 (50793064)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | SETX / 減数分裂 / R-loop |
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| Outline of Research at the Start |
R-loopは、解離した2本鎖DNAと新生RNAからなる3本鎖核酸構造であり、新たなエピジェネティック調節機構として注目を集めている。R-loop構造は不安定な構造でDNA損傷の原因となり得る為、SETXやRNaseHといった因子によって解消される。SETX欠損マウスの精子形成は、第一減数分裂前期パキテン期で停止する一方で、SETX欠損雌マウスは、妊性を維持している。しかし、卵形成過程におけるR-loopの役割は全く解明されていない。本研究は、独自に保有・樹立を目指す複数のモデルマウスを用いて、SETXとR-loopが持つ雌雄配偶子形成における役割と、その制御機構の解明を試みる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
独自のFACSセルソーティング技術を用いて高純度で分画した精母細胞におけるR-loopおよびSETXのゲノム局在を、CUT&Tag法により解析し、精母細胞で高発現する遺伝子群のプロモーター領域にSETXおよびR-loopが局在することを明らかとした。さらに、Setx欠損精母細胞では、SETXおよびR-loopが多く局在するゲノム領域にDNAダメージが蓄積していることが明らかとなった。これは、SETXを欠損することによりR-loopが解消されず異常に蓄積してしまったからだと思われる。そこで、独自のFACSセルソーティング技術を用いてSetx欠損精母細胞を高濃度に分画し、CUT＆Tag法を計画したが、幼若齢のマウスを3匹程度使用したが十分な細胞数を得ることすることができなかった。そこで、成体のSetx欠損マウス複数匹を用いて精母細胞の分画を試みたが、CUT&Tagに必要な細胞数を得ることに成功し、現在CUT&Tag解析を進めているところである。
本年度はSetx突然変異マウスを用いた解析と並行して本研究に関連する論文執筆に尽力した。まず、Setx突然変異マウスであるspcar3マウスの表現型解析の原著論文を、研究代表者を筆頭著者として Reproduction誌に発表した。本論文では、雄マウスの精子形成における詳細な表現型に加え、雌マウスの繁殖能力に関してのデータを公表した。また、本研究で予定している卵母細胞の分画技術開発の基盤となる、独自のFACSセルソーティング技術をメソッド論文としてCytology PartA誌に原著論文として研究代表者を筆頭著者として発表した。さらに、精母細胞におけるR-loop局在とSETXの精母細胞における転写制御機構に関する論文を、研究代表者を筆頭著者として原著論文の執筆を進めており本年度中の発表を目指している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は論文執筆に多くの時間を必要としたため、実験に十分な時間を割くことが出来なかったことが、研究の進行にやや遅延が生じている理由である。しかし、上記の通りトランスクリプトームやエピゲノム解析からも興味深い結果が得られており、今後の進展が期待できる状態である。
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| Strategy for Future Research Activity |
精巣特異的Setxバリアントの得意的な突然変異マウス、ヘリカーゼ活性欠損マウス、SETXタグ標識KIマウスなどの作成を進める。新たなモデルマウス作成に必要なマイクロインジェクション実験に必要な機材を現在手配しており、納品され次第新たなモデルマウス作成に取り掛かる。さらに、卵母細胞得意的に分画する技術開発にも取り組む、具体的には本年度発表した独自のFACSセルソーティング技術に用いたダブルTGマウスをさらに発展させ、精母細胞得意的に蛍光標識s他H4を発現するモデルマウスの作成にも着手する。また、上記のSETXのエピゲノム解析に関する原著論文執筆も進めている。
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