| Project/Area Number |
21K15081
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 44010:Cell biology-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
橋村 秀典 東京大学, 大学院総合文化研究科, 特任研究員 (50897410)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2025: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | ミトコンドリア / 細胞運動 / 細胞極性 / 細胞内シグナル伝達 |
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| Outline of Research at the Start |
細胞運動時にミトコンドリアが偏った配置を示すことが近年明らかにされつつあるが、そのような配置が細胞運動の制御にどのような役割を果たすかは不明な点が多い。本研究は、細胞運動についての知見の蓄積のある細胞性粘菌アメーバを用いて、細胞運動時の極性形成やその維持にミトコンドリアの配置がどのように影響するかを明らかにすることを目指す。ランダムな自発運動に加え、明確な前後極性が形成される走化性時のミトコンドリアの配置と細胞極性の関係性を蛍光イメージングにより測定する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は細胞性粘菌における細胞内のミトコンドリアの配置と細胞内シグナル伝達の関連性を探るため、特にカルシウムシグナルに着目し、細胞内カルシウム濃度のミトコンドリアの同時測定を行った。細胞性粘菌において高感度でカルシウム濃度変化を可視化できる蛍光プローブGCaMP6sをミトコンドリアを可視化するプローブと同時に発現させた株を作成した。この株を用いて、灌流による走化性勾配を与えた際の極性を持った運動時のミトコンドリア配置と細胞内カルシウム濃度の関連性を調べた。
また、これまで観察を行なっていた細胞骨格・ミトコンドリアの同時イメージングに加え、収縮胞・小胞体などの膜系ネットワークや核とミトコンドリアを同時に可視化する系を立ち上げ、運動時におけるオルガネラ間の位置関係を調べた。これまで細胞性粘菌で使用例のなかったUV励起の青色蛍光タンパク質および近赤外蛍光タンパク質などを用いることで、最大５チャンネルの蛍光イメージングを行えるようになった。これにより細胞骨格・細胞膜に加えてミトコンドリア、小胞体ネットワーク、核を同時に観察することができ、明確な極性を持った運動時ではないが、細胞の自発的な運動においてミトコンドリアの細胞内配置の決定に小胞体ネットワークが関与する可能性を見出した。
また、細胞内のミトコンドリアの配置が細胞運動や極性に与える影響を調べるため、細胞内においてミトコンドリアが異常な配置を起こすことが知られる変異体をCRISPR/Cas9を用いて作成することを試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ミトコンドリアの配置と細胞運動・極性の関連を調べるべく、ミトコンドリアの細胞内配置に異常をきたすことが報告されている変異体をCRISPR/Cas9の技術を用いて作成しようと複数回試みたが、単離することができなかった。過去に単離された変異体は相同組み換えによる遺伝子破壊から単離されていたので、今後そちらの手法も検討する。また、ATP/ADP比の測定を行うための株作成を計画していたが、カルシウムプローブ発現株や他のオルガネラマーカー発現株の作成に時間がかかったため、まだそちらの株作成には取り掛かれていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに作成したオルガネラマーカー、特に小胞体マーカーを用いて、極性運動を行う際のミトコンドリアの配置と小胞体ネットワークの位置関係に着目した測定を行う。灌流系を用いて走化性運動を観察し、勾配逆転における細胞の方向転換時に起きるミトコンドリアの細胞内配置の変化が小胞体ネットワークに対しどのような位置関係で起きるかなどを解析する。また、昨年度に引き続きATP/ADP比の測定が可能な蛍光プローブを安定的に発現する株の作成も進めていく。必要に応じて、小胞体ネットワーク構造の異常を引き起こす遺伝子欠損をCRISPR/Cas9によって作成を試みる。
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