| Project/Area Number |
21K15125
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 44030:Plant molecular biology and physiology-related
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
加藤 大貴 愛媛大学, 理工学研究科(理学系), 助教 (30846994)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | ゼニゴケ / ホルモン / シグナル伝達 / 進化 |
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| Outline of Research at the Start |
オーキシンは陸上植物の生活環全体で発生と成長を制御する主要なホルモンである。近年、オーキシンが転写因子WIPの発現を促進するという経路が陸上植物に共通することを見出し、WIPの分子機能の解明が陸上植物における多様なオーキシン機能の基本形と進化を理解する鍵だと考えた。本研究では遺伝的冗長性の低いゼニゴケを研究モデルに、WIPの遺伝的・物理的な相互作用因子に着目し、オーキシン-WIP経路が多面的な機能を果たす分子メカニズムの解明に取り組む。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではゼニゴケをモデルに（１）WIPの標的遺伝子の網羅的探索と結合配列の推定、（２）生化学的・遺伝学的アプローチによるWIPと相互作用するタンパク質の探索、（３）組織特異的な複合体形成による下流応答制御の検証を計画しており、本年度は（１）、（２）について以下のような成果を得た。
これまでに計画（１）に必要なクロマチン免疫沈降シーケンス解析（ChIP-seq）、および計画（２）に必要な共免疫沈降-質量分析を行うために、エストロゲン依存的にGFPタグを融合したWIPタンパク質を発現する株の作成を試みていた。しかしエストロゲン処理により表現型を示す株が得られず、GFPタグがWIPの機能を阻害している可能性が考えられた。そこで昨年度にタグをGFPよりも分子量が小さく機能阻害を起こしにくいと予想される3xFLAGに変更してゼニゴケへの形質転換を行い、エストロゲンによりWIP遺伝子の転写誘導と発生異常を示す株を得ることができた。しかし形質転換体を１株しか得られておらず遺伝学的解析には不十分であったため、今年度に再度ゼニゴケへの形質転換を行い、エストロゲンによりタグなしWIPタンパク質過剰発現株と同様の表現型を示す株を合計で３株取得することができた。また得られた株からタンパク質抽出を行い、抗FLAG抗体を用いたウェスタンブロッティングによるWIP-3xFLAGタンパク質の検出を試みたところ、エストロゲン誘導後にWIP-3xFLAGと推定される分子量の位置のバンドを検出することができた。この結果からWIP-3xFLAGタンパク質を発現株する株の確立に成功したと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
研究指導を行う学生、担当する授業科目や学内委員会の数が前年度と比べて増加したことにより、本研究の遂行に費やせる時間が減少し、当初の計画通りに実験を行うことができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の計画は大きく（１）WIPの標的遺伝子の網羅的探索、（２）WIPの相互作用因子の探索、（３）組織特異的な複合体形成の検証に分けられる。しかし（３）は（１）、（２）の成果を前提としているため、次年度は（１）、（２）に注力し以下のような方策で研究を遂行する。
（１）WIPの標的遺伝子・結合配列を同定するため、本年度に作成したエストロゲン依存的に3xFALGタグ融合WIPを発現する株（XVE>>WIP-FLAG）を用いてChIP-seq解析を行う。その際、過去に行った機能欠損変異体および過剰発現株を用いたRNA-seq解析と発現変動遺伝子のプロモーター解析のデータを参考にする。
（２）XVE>>WIP-FLAG株を用いて免疫沈降-質量分析法方による相互作用同定を試みる。これまでの解析により同定されたWIPと共発現する転写因子や、（１）で同定したWIP結合配列の情報を合わせて相互作用因子候補を同定する。
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