| Project/Area Number |
21K15144
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 45020:Evolutionary biology-related
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
別所 学 (別所ー上原学) 名古屋大学, 学際科学フロンティア研究所, 助教 (80880434)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2024: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000)
Fiscal Year 2023: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
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| Keywords | 盗タンパク質 / 生物発光 / キンメモドキ / ルシフェラーゼ / トランスクリプトーム解析 / ウミホタル |
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| Outline of Research at the Start |
ユニークな形質を持つ生物は、それらが独自の遺伝子をゲノム中に獲得することで進化したと考えられてきた。ところが、発光魚キンメモドキは、発光に必要な酵素遺伝子をゲノム中に持たず、餌であるウミホタルから発光酵素(ルシフェラーゼ)を獲得していることが、 申請者の研究により明らかとなった。「餌由来のタンパク質が消化されずに特定の器官の細胞に取り込まれ、さらに、本来の酵素機能が保持される」現象（盗タンパク質現象）の取込みの分子・細胞生物学的メカニズムおよび進化的起源は未知である。本研究では、キンメモドキにおいて餌由来タンパク質を細胞内に取込む仕組みの解明 と本現象がみられる新たな生物種の発見を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
発光魚キンメモドキParapriacanthus ransonneti（ハタンポ科）は、発光性甲殻類トガリウミホタルCypridina noctilucaのルシフェラーゼタンパク質を発光器に取り込むが、その動態は不明である。また、免疫組織化学による染色像より発光細胞の細胞質にルシフェラーゼが存在することから、細胞膜介在性の取り込み機構などによりルシフェラーゼが取り込まれていると予想される。すなわち、細胞膜に局在するトガリウミホタルルシフェラーゼ受容体の存在を想定して、これを同定することを目指す。
ルシフェラーゼ抗体を用意し、これを用いてキンメモドキの発光器由来のタンパク質粗抽出物に対して免疫共沈降法による受容体の同定を試みた。しかしながら、夾雑タンパク質が多く、有力な候補を得ることができなかった。
本年度は、ゲノム・トランスクリプトーム解析を行い、発光器特異的な遺伝子の探索を行った。PacBioシーケンサーによるロングリードを用いたゲノム解読を行なった。その結果、高品質なドラフトゲノム（N５０＝１３M b）を得ることができた。作成したゲノム情報とすでにえら得ていたトランスクリプトーム情報を統合して解析することで、De novoトランスクリプトーム解析では解釈が困難なパラログの解析や、大きな遺伝子の解析を、ゲノム情報を整備することで解決した。今後は、発光器特異的遺伝子の機能解析を培養細胞系で発現させて行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、前年度までの進捗をうけて、比較トランスクリプトーム解析を進め、ルシフェラーゼの取り込みに関与すると考えられる遺伝子の候補を得た。すなわち、発光器における発光細胞の細胞膜上でルシフェラーゼと結合する受容体の候補遺伝子をバイオインフォマティクス解析から見出した。しかし、当該遺伝子は非常に長く、ショートーリードを用いた遺伝子予測では全長を復元推定することができなかった。そこで本年度は、PacBioシーケンサーによるロングリードを用いたゲノム解読を行なった。その結果、高品質なドラフトゲノム（N５０＝１３M b）を得ることができた。これを用いて遺伝子カタログを作成した。作成した遺伝子カタログに対して、トランスクリプトーム解析を行なったところ、上記と同じ候補遺伝子を得ることができ、再現性が担保された。
また、ハタンポ科に属する１種とハタンポ科に近縁なアオバダイ科の１種のトランスクリプトームデータを得ることができた。これらを用いて、キンメモドキのゲノム・トランスクリプトームデータと比較し、発光形質や盗タンパク質に関わる遺伝子群を網羅的に解析することができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
ルシフェラーゼの受容体候補遺伝子の全長クローニングを行い、培養細胞系で発現させ機能解析を行う。機能解析のためにトガリウミホタルルシフェラーゼを受容体の相互作用相手として調製する必要があるが、当該タンパク質はシステインを多数含み一般的な大腸菌E. coli (DE) BL21などでの発現が困難である。そこで、メタノール資化酵母Pichia pastorisを用いてこれを発現する。作成したルシフェラーゼを細胞培養液に添加し、結合能をルシフェラーゼ活性（発光強度）を用いて評価する。
また、ハタンポ科に属する１種とハタンポ科に近縁なアオバダイ科の１種のトランスクリプトームデータを、キンメモドキのゲノム・トランスクリプトームデータと比較し、発光形質や盗タンパク質に関わる遺伝子群を網羅的に解析する。
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