| Project/Area Number |
21K15145
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 45020:Evolutionary biology-related
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
松原 遼 鳥取大学, 医学部, 助教 (90868514)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 実験進化発生学 / 有尾両生類 / 四肢形態形成 / Tbx3 / Shh / Tbx4/5 / 形態的多様性 / CRISPR-Cas9 / CRISPR -Cas9 / Gli3 / 進化発生学 / 四肢 / 指 / イベリアトゲイモリ / ゲノム編集 |
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| Outline of Research at the Start |
動物は多様な指形態を持っているが、多様性を生み出す統一原理は明らかにされていない。進化的には四肢発生における後方関連遺伝子が指形成領域で前方へと迫り上がることで指が獲得されたと考えられているが、それを示す証拠はない。本研究ではまずイモリの前肢（４本指）と後肢（５本指）の違いをもたらすメカニズムとして、後方関連遺伝子の一つであるhoxd13遺伝子に着目し、指形態との関係性を明らかにする。さらにCRISPR-Cas9による遺伝子ノックアウトとトランスジェニック技術を併用することで、イモリに実験的に多様な指形態を創り出し、指形態と遺伝子、進化との関係性を明らかにするという実験進化発生学を展開する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はイモリを用いた実験発生学により、進化によって生じた指形態の多様性の発生メカニズムを明らかにすることを目的としている。イモリは前肢と後肢で異なる本数の指数を持つことから、イモリでShh発現の変化によって指本数の変化がもたらされるのか（研究内容１）、さらにShh発現を調節可能な因子は何か（研究内容２）、を明らかにするため解析を進めた。
研究内容１に関しては昨年度までに、イモリ前肢・後肢のShhとHoxd13の発現比較解析、Hoxd13発現誘導実験、Shhの機能阻害実験等を試みた。今年度はより詳細な発現解析として、Shhノックイン（KI）イモリの作製を進め、Shh発現細胞が追跡可能な個体を作製した。その結果、前肢と後肢でShh発現細胞が寄与する指の本数に大きな違いは見られなかった。このことはShhシグナルを受け取った細胞の振る舞いに前肢と後肢で差があることを示唆している。
研究内容２に関して、昨年度までにShhの制御因子の一つであるTbx3の遺伝子機能欠損イモリ（変異体）を作製し、前肢と後肢の指で異なる表現型が生じることを明らかにした。この変異体においてShh発現は、前肢では野生型に比べて発現低下（もしくは早期発現消失）、後肢では発現延長が起きることを明らかにした。今年度はTbx3変異体の前肢・後肢間で表現型が異なる要因を明らかにするため、他のTbx遺伝子とTbx3との関係性に着目して解析を行なった。その結果、前肢・後肢それぞれで特異的に発現しているTbx5・Tbx4とTbx3との関係性が、Tbx3 変異体で前肢・後肢間で異なる表現型が生じる要因となる可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新規解析手法を導入するための準備に時間を要した。研究内容１に関してはShh KI個体の作出効率が低く、それを改善するための条件検討が必要であった。また、研究内容２において、解析に使用する発現コンストラクトの作製に想定以上の時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究内容１に関して、KIによる解析を今後も進めると共に、系統化によって再現性の高いデータを得る。また、新規解析手法として感度の高いHCR（hybridization chain reaction）in situ法を導入し、これまでに得られている発現解析結果をより確かなものとする。さらに、指形態に変化をもたらすと考えられる候補遺伝子（Shh、Gli1、Hoxa13+Hoxd13）の発現誘導可能なトランスジェニックの系統作出について、継続して進める。
研究内容２に関しては、再現性を得るため実験の回数を重ねることに注力する。さらにTbx3のパラログであるTbx2も加えたTbx2/3/4/5の相互作用を明らかにするため、多重変異体の作製と解析、培養細胞とShhの制御配列を用いたTbx転写因子間の相互作用解析を行なう。
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