ヒト血液脳関門のモデル構築を基礎にしたゴーシェ病神経機能障害の病態解明

• Project/Area Number: 21K15297
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 47060:Clinical pharmacy-related
• Research Institution: Tokyo University of Pharmacy and Life Science (2022); Kumamoto University (2021)
• Principal Investigator: 白井 玲美奈 東京薬科大学, 生命科学部, 嘱託助教 (40870754)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2021: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
• Keywords: 血液脳関門 / ゴーシェ病 / 中枢神経機能 / iPS細胞 / 病態解析 / 神経機能 / 病態解明

Outline of Research at the Start

ゴーシェ病は中枢神経症状を主とするが、酵素がBBBを通過できないため効果が乏しい。既存の動物BBBモデルではヒトBBBを反映しないため、有用な治療薬開発の足枷になっている。
本研究では、ヒト由来BBBモデルを構築し、ゴーシェ病における中枢神経機能の改善にアプローチする。
健常者由来iPS細胞をBBB構成細胞へ分化誘導し、健常BBBモデルと神経の機能評価系の構築を試みる。ゴーシェ病由来の疾患iPS細胞からBBBモデルを確立し、健常BBBと比較する。次に、健常細胞とゴーシェ病細胞でBBBにおける構成細胞の組み合わせ変更し、薬剤透過性の変化を解析する。さらに、ゴーシェ病由来の神経細胞とミクログリアを樹立し、中枢神経機能を解明する。

Outline of Annual Research Achievements

ゴーシェ病は、β-グルコシダーゼ変異によりライソゾーム内のグリコセレブロシダーゼ活性が低下あるいは欠損することが病因である。その基質である糖脂質のグルコセレブロシドが、全身の組織に蓄積すると中枢神経障害を起こす難病であるが、根治療法はなく、主に酵素補充療法が用いられている。しかし、血液脳関門により酵素の通過が困難であるため、神経症状に対する効果は期待できない。
これまで開発された動物細胞によるin vitroの血液脳関門モデルは、血液脳関門トランスポータータンパク質発現量がヒトと動物で異なる、という難点がある。そこで本研究では、ヒト細胞から血液脳関門モデルを構築し、健常由来とゴーシェ病由来の比較による機能障害の解明を試みた。初年度では、まず、血液脳関門モデルを構築するため、ゴーシェ病由来iPS細胞から血管内皮細胞の誘導を行い、内皮細胞マーカーの発現を確認し、ライソゾームマーカーの発現を検討した。また、ゴーシェ病の中枢神経機能を解析するために、iPS細胞から神経細胞とミクログリアを誘導し、神経幹細胞マーカー、神経細胞マーカーの発現を検討した。さらに、生細胞測定試薬によって、細胞のviabilityについて検討した。
本年度では、ヒト初代培養神経細胞やペリサイトにおいて、CRISPER-CasRxを用いたβ-グルコシダーゼのノックダウンを行った。そのため、ヒトβ-グルコシダーゼのmRNA情報をNCBIからダウンロードし、CRISPER mRNAを設計した。mRNAの設計にはApEを用い、ガイドRNAを付加した2種類のCRISPER mRNAを作製した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

初年度では、健常者またはゴーシェ病由来iPS細胞から血管内皮細胞をそれぞれ1クローンずつ誘導した。iPS細胞を内皮細胞の4種類の誘導因子存在下で6日間培養し、内皮細胞マーカーポジティブな分画をソートした。蛍光免疫染色においても、内皮細胞マーカーの発現を確認したところ、その発現には差は見られなかった。次に、ライソゾームマーカーであるLysotrackerで蛍光染色し、その蛍光強度を測定したところ、ゴーシェ病由来血管内皮細胞は、健常者由来と比較して有意に減少していた。このとから、疾患細胞内におけるライソゾームの減少が示唆された。次に、iPS細胞から神経幹細胞を誘導し、神経細胞とミクログリアへの分化誘導を行った。ミクログリアはiPS細胞から胚様体の形成後、マクロファージ前駆細胞を経て、IL-4、GM-CSF存在下で誘導した。より成熟したミクログリアを維持するため、健常者由来神経細胞との共培養を試みた。得られたミクログリアにおける神経幹細胞マーカーや神経細胞マーカーの発現をqRT-PCRで検討したところ、健常者由来と比較してゴーシェ病由来ミクログリアではMAP2とTUJ1のmRNA発現が有意に増加していた。次に、WST-8アッセイによって細胞のviabilityを検討した。健常者由来と比較してゴーシェ病由来ミクログリアとの共存により、神経幹細胞の生存数が有意に減少していた。
本年度では、ヒト初代培養神経細胞またはペリサイトにおけるβ-グルコシダーゼのノックダウンを行った。まず、ヒトβ-グルコシダーゼのmRNA情報をNCBIからダウンロードし、CRISPER mRNAを設計した。mRNAの設計にはApEを用い、ガイドRNAを付加した2種類のCRISPER mRNAを作製した。

Strategy for Future Research Activity

初年度は、3種類の血液脳関門構成細胞のうち、iPS細胞から血管内皮細胞の誘導に成功した。今年度は、ヒト初代培養神経細胞またはペリサイトのβ-グルコシダーゼをノックダウンするため、CRISPER mRNAを設計し、作製した。計画当初は、iPS細胞から血液脳関門構成細胞を誘導し、その機能解析を行う予定だったが、研究代表者の異動によりiPS細胞の使用が困難になったため急遽、ヒト初代培養細胞の使用に変更した。現在はヒト初代培養神経細胞、アストロサイト、ペリサイトそれぞれにCRISPER mRNAを導入し、β-グルコシダーゼの発現を確認している。最終年度の令和5年度は、β-グルコシダーゼ CRISPER mRNAを導入した血液脳関門構成細胞において、細胞マーカーの発現を確認する予定である。また、トランスウェルを用いた3種類の細胞の共培養により、ヒト血液脳関門モデルの構築を目指す。