| Project/Area Number |
21K15365
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 48040:Medical biochemistry-related
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
星 京香 福島県立医科大学, 医学部, 博士研究員 (00726995)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | Rif / 肺腺がん / 低分子量Gタンパク質 / 核膜 / Rhoファミリー / SmgGDS / GDP-GTP交換因子 / 癌細胞遊走 / 糸状突起 |
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| Outline of Research at the Start |
細胞の糸状突起は、細胞遊走においてガイダンス因子を感知するアンテナとして機能する他、細胞外基質との接着を介して遊走の足場を形成したり細胞外基質を再構築する機能を担っている。低分子量Gタンパク質Rifは肺癌細胞などにおいて過剰発現し、癌細胞に糸状突起形成に誘導することで癌細胞遊走を制御していることが示唆されている。しかし、Rifの活性や機能がどのように制御されているのかは明らかでない。本研究では、癌細胞におけるRifの活性制御機構と癌細胞遊走における機能を明らかにすることにより、癌浸潤・転移のメカニズム解明を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
Rifの細胞内局在とGTP結合能との関連を解析するため、核局在シグナルおよび核外移行シグナルを付加したRifを培養細胞に発現させ、それぞれのRifのGTP結合型の量をGST-mDia1RBDタンパク質を用いたプルダウン解析により検討した。その結果、いずれのRifも野生型と同等のGTP結合能を有していることが確認された。したがって、RifのGTP結合能は細胞内局在によって変化しないことが示唆された。次に、内在性Rifの細胞内局在を免疫蛍光染色法を用いて解析した。抗Rif抗体としては、自作のウサギポリクローナル抗体と市販の二種類のウサギポリクローナル抗体を用いた。まず、抗Rif抗体の感度および特異性を評価するため、RifノックアウトPC9細胞にYFPまたはYFP-Rifを発現させ、免疫染色を行った。その結果、自作抗体および一社のメーカーの抗体がYFP-Rifを特異的に認識することが確認されたが、シグナル：ノイズ比においてメーカー抗体の方が優れていることが明らかとなった。そこで、このメーカー抗体を用いて野生型およびRifノックアウトPC9細胞の免疫染色を行ったところ、野生型細胞において特異的に染色されるシグナルはほとんど検出されなかった。さらに、ヒト肺腺がん組織マイクロアレイを用いた免疫組織化学染色の結果、37/42検体においてがん細胞に明確な染色が認められ、正常組織には染色が見られなかった。また、多くのがん細胞においてRifが細胞質および核に局在することが示された。これにより、培養がん細胞での細胞質―核分画によるRifの局在解析結果と同様に、肺腺がん組織においてもRifががん細胞の細胞質および核に局在することが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Rifの細胞内局在とGTP結合能との関係を明らかにすることに成功した。内在性Rifの免疫染色による局在解析において、培養がん細胞では適切に検出できなかったものの、がん細胞組織を用いた免疫組織化学染色により、内在性Rifのがん細胞内局在を明確に示すことができた。一方、in vitro実験に時間を要したためマウスを用いた解析に着手する事ができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
PC9細胞における内在性Rifの細胞内局在解析において、明確なRifの染色が認められなかったことから、適切な固定方法および染色方法を検討し、適切な検出方法を確立する必要がある。その検出方法を用いて、糸状突起や浸潤突起の誘導条件下で培養したPC9細胞におけるRifの細胞内局在を解析する。また、三次元ゲル中のPC9細胞塊においても同様に免疫染色を行い、リーダー細胞とフォロワー細胞における内在性Rifの細胞内局在の違いを明らかにする。さらに、Rif結合タンパク質として同定されたSmgGDSがRifの細胞内局在および活性制御に関与している可能性について今年度も引き続き検討する。具体的には、SmgGDSノックアウトがん細胞におけるRifの細胞内局在解析とマウスでの腫瘍形成能の解析を実施する。
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