脱細胞化骨を用いた、新しい人工ヒト骨髄およびヒト骨髄異形成症候群モデルの作成
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21K15414
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 49030:Experimental pathology-related
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
大西 威一郎 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 助教 (70750214)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | 骨髄間葉幹細胞株 / 脱細胞化骨 / CRISPR library / 骨髄間葉幹細胞 / ヒト化骨髄微小環境 / 骨髄異形成症候群 |
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| Outline of Research at the Start |
ヒト骨髄間葉幹細胞株を脱細胞化骨の移植前に生着させ、これをマウス の皮下へ移植することで、ヒト骨髄微小環境を再現する。CRISPR libraryによる網羅的かつランダム な変異を導入することで、ヒト間葉幹細胞株に多様性を誘導し、効率的な生着、生着後の骨髄再構 築機能強化を図り、ヒト骨髄微小環境の構築を試みる。同時に骨髄異形成症候群で同定されている 骨髄間葉細胞の遺伝子変異を導入することにより、病的なヒト骨髄組織に起因した、骨髄異形成症 候群発症マウスモデルの作成を目指し、骨髄微小環境を正常にする新しい治療法を提案する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
2022年度は、ヒト骨髄間葉幹細胞株UE7T-9細胞の脱細胞化骨への進展因子として、CRISPR activation library(SAM library))で同定したSHC4について、SHC4過剰発現細胞株のRNA sequence 解析を施行し、Cell motilityに関する因子の発現亢進を得た。この成果については、Bioengineering誌に報告した。
CRISPR knock out library(GeCKO v2 library)で同定したSRRM4については、SRRM4 Knock out(KO) UE7T-9細胞株をCRISPR lenti v2にて作成し、限界希 釈からのcloningを行なった。完全なKO細胞株は樹立できなかったものの、部分的なKOは確認できた細胞株を樹立した。増殖能の評価(MTS assay), 移動能の評価(Scratch assay)、足場非依存性(Soft agar assay)を行ない、SRRM4KO細胞株では、対照群と比較して、増殖能には変化が なかったが、移動能の亢進と、足場非依存性の増殖が認められた。また脱細胞化骨への進展も、確認された。RNA sequence 解析では、Extracellular matrixやCytokine activityに関する因子の発現亢進を得た。SRRM4に関する結果についても、論文投稿の準備を進めている。
2022年度は、上記樹立細胞株の、脱細胞化骨への進展、生着率が著明に低下しており、細胞のcloningなどをやり直ししたが、生着率の改善に乏しかった。その原因として、2022年度に使用した脱細胞化骨について、生理食塩水下で長期保存により、品質として劣化した可能性が考えられる。今後は用いる脱細胞化骨の都度作製なども検討する。また、マウス皮下への移植も進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
脱細胞化骨への進展、生着率が著明に低下しており、細胞のcloningなどをやり直したため。また、脱細胞化骨について、保存による劣化や都度作製についても、再検討する必要が生じたため。
マウスへの皮下移植実験も行ったが、マウスの造血環境構築には、月単位の経過観察が必要なことが判明したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
脱細胞化骨への進展、生着率の改善を求むべく、脱細胞化骨について都度作製の方針とする。
マウス皮下にて、UE7T-9細胞の生着が認められれば、 DICER1KO細胞株も作成し、造血細胞の異形成や腫瘍化誘導の有無を確認していきたい。
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Report
(2 results)
Research Products
(11 results)
