Elucidation of the mechanism of disease severity caused by SARS-CoV-2 focusing on the incompatibility between by virus and host

• Project/Area Number: 21K15455
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 49060:Virology-related
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 荒井 泰葉 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (80793182)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2023-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: SARS-CoV-2 / RIG-I / 新型コロナウイルス / 宿主適応 / 重症化

Outline of Research at the Start

新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）感染患者において血栓症や多臓器不全による重篤化が 問題となっているが、その重症化機序は解明されていない。長期間ヒトで流行しヒト適応性を獲得しているヒトコロナウイルス（hCoV）と異なり、SARS-CoV-2は野生動物を 起源とし、今まさに野生動物からヒトへの宿主障壁を超えようとする過渡期にある。そのため、複製に利用する宿主因子との不適合に起因して複製過程にエラーが生じやすいと推定される。
我々はSARS-CoV-2がhCoVと比較して、その複製過程において200b以下の短鎖viral RNAを顕著に多く産生することを見出している。本研究では当該RNAを介したSARS-CoV-2の重症化機序を解明することを目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

初年度では、短鎖viral RNAの代表的な配列に基づき複数種の短鎖viral RNAをin vitro transcription により合成し、当該RNAの配列と長さの違いによるサイトカイン誘導性を解析した。また、合成した短鎖viralRNAの特徴（二次構造、脱リン酸化、キャップ構造の有無）によるサイトカイン誘導性を確認することで、非自己RNAセンサーによる短鎖viral RNAの認識機構を明らかにした。さらに、非自己RNAセンサーをsiRNA導入によりノックダウンし、短鎖viral RNAによる免疫誘導の消失を確認している。
本年度では、短鎖viral RNA代表配列を対象としたstem-loop RT-PCRを構築し感染経過時間ごとに細胞中における短鎖viral RNA量を定量し、細胞内での非自己RNAセンサーの発現量との関連性を評価した。また、本研究で対象とする短鎖viral RNA はその長さから、宿主のmicro RNAのようにエクソソーム中に効率よく含有されると予想されるため、感染細胞培養上製中に含まれるエクソソームを単離し、small RNA-seqにより解析を行った。
これらの解析により、細胞中の短鎖viral RNA量が感染後期において細胞内に多く蓄積され、相関して非自己RNAセンサーの発現も上昇することを確認した。またエクソソーム中においては、感染細胞中と同様の短鎖viral RNAを検出することができた。

本研究では新型コロナウイルスが産生する短鎖viral RNAに着目し、当該RNAが感染時病態の重症化に与える影響について評価した。短鎖viral RNAはその特徴から、細胞内のサイトカイン産生を強く誘導しており、生体内で短鎖viral RNAが多量に産生される場合にはサイトカインストームを引き起こす一因子なり得ると推察される。

Research Products

• [Journal Article] Stimulation of interferon-β responses by aberrant SARS-CoV-2 small viral RNAs acting as retinoic acid-inducible gene-I agonists (2023)
  • Author(s): Arai Yasuha、Yamanaka Itaru、Okamoto Toru、Isobe Ayana、Nakai Naomi、Kamimura Naoko、Suzuki Tatsuya、Daidoji Tomo、Ono Takao、Nakaya Takaaki、Matsumoto Kazuhiko、Okuzaki Daisuke、Watanabe Yohei
  • Journal Title: iScience Volume: 26 Issue: 1 Pages: 105742-105742
  • DOI: 10.1016/j.isci.2022.105742
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] ACE2 N-glycosylation modulates interactions with SARS-CoV-2 spike protein in a site-specific manner (2022)
  • Author(s): Isobe Ayana、Arai Yasuha、Kuroda Daisuke、Okumura Nobuaki、Ono Takao、Ushiba Shota、Nakakita Shin-ichi、Daidoji Tomo、Suzuki Yasuo、Nakaya Takaaki、Matsumoto Kazuhiko、Watanabe Yohei
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 5 Issue: 1 Pages: 1188-1188
  • DOI: 10.1038/s42003-022-04170-6
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] ACE2 N-glycosylation modulates interactions with SARS-CoV-2 spike protein in a site-specific manner (2022)
  • Author(s): Ayana Isobe, Yasuha Arai, Nobuaki Okumura, Takao Ono, Shin-ichi Nakakita, Tomo Daidoji, Yasuo Suzuki, Takaaki Nakaya, Kazuhiko Matsumoto, Yohei Watanabe
  • Organizer: 日本ウイルス学会
• [Presentation] Stimulation of IFN-beta responses by aberrant SARS-CoV-2 small viral RNAs (2022)
  • Author(s): Yasuha Arai, Itaru Yamanaka, Toru Okamoto, Ayana Isobe, Naomi Nakai, Naoko Kamimura, Tatsuya Suzuki, Tomo Daidoji, Takaaki Nakaya, Daisuke Okuzaki, Yohei Watanabe
  • Organizer: 日本RNA学会