3D培養腎細胞を用いた腎臓病早期診断法の開発と新規治療薬探索

• Project/Area Number: 21K15663
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 52010:General internal medicine-related
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 越智 ありさ 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教務補佐員 (30831797)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2025: ¥130,000 (Direct Cost: ¥100,000、Indirect Cost: ¥30,000); Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: CKD / スフェロイド / バイオマーカー / エクソソーム / 慢性腎臓病 / 早期診断法 / ３D培養

Outline of Research at the Start

腎臓の主な機能を担う糸球体は、多種の細胞から構成されるため従来の個々の培養細胞による検討では、生体内での現象を再現することは困難であった。そこで、腎由来細胞の3D共培養を行い、糸球体様/尿細管様スフェロイドを作製した。作製したスフェロイドに腎臓病の起因に関与する種々のストレスを添加し、変動する分子の解析により腎臓病を早期診断できるバイオマーカーの探索を行う。また、バイオマーカーの尿中からの検出法の確立を目指す。さらに、スフェロイドに腎臓病患者由来の血清を添加すると、その形態が崩壊することを確認しているため、スフェロイドの形態を維持する化合物のスクリーニングを行い、新規腎臓病治療薬の探索を行う。

Outline of Annual Research Achievements

腎炎の診断方法といて重要とされるのは、腎臓に線維化やそれらを引き起こす腎炎の早期に診断を確定させることである。
二次元培養細胞系では、多くの細胞種より構成される腎臓で起こる現象を再現することは困難であった。そこで、より生体内に近い形質を有する糸球体様および尿細管様スフェロイドを用い、腎臓病を模倣するモデル培養系の作製を行った。
腎臓病モデル培養系において、スフェロイドでは線維化マーカー（SMA,Col4)の発現より早期に既存の細胞障害マーカーであるkim-1およびNGALの発現が増加することを確認した。また、線維化マーカーおよび細胞障害マーカー発現時のスフェロイド培養上清を回収し、エクソソームの抽出を行った。回収したスフェロイドおよび培養上清中のエクソソームからRNAを抽出し、RNA sequenceを用いて腎臓病早期バイオマーカー候補の選定を行った。
スフェロイドを用いた検討より選定したバイオマーカー候補分子が、腎臓病早期において検出可能か検討するため、db/dbマウス4～12週齢の尿および腎臓を回収した。db/dbマウスの4、6、10週例の組織をHE染色および炎症マーカーであるKim-１の免疫染色を行い、腎炎の表現型が表れていないことを確認した。その個体の尿において、先に作製した腎スフェロイドより同定したバイオマーカー候補分子の発現量のをｍRNAレベル、タンパク質レベルにて検討を行った。

Research Products

• [Journal Article] TGF-β1 is involved in senescence-related pathways in glomerular endothelial cells via p16 translocation and p21 induction (2021)
  • Author(s): Ueda Sayo、Tominaga Tatsuya、Ochi Arisa、Sakurai Akiko、Nishimura Kenji、Shibata Eriko、Wakino Shu、Tamaki Masanori、Nagai Kojiro
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 11 Issue: 1 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1038/s41598-021-01150-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Dual disruption of eNOS and ApoE gene accelerates kidney fibrosis and senescence after injury (2021)
  • Author(s): Kenji Nishimura、Kensei Taguchi、Seiji Kishi、 Craig R Brooks、Arisa Ochi、Hiroyuki Kadoya、Yasumasa Ikeda、Masashi Miyoshi、Masanori Tamaki、Hideharu Abe、Ken-Ichi Aihara、Naoki Kashihara、Kojiro Nagai
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 556 Pages: 142-148
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2021.03.111
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 高吸水性ポリマーを用いた新規細胞外小胞精製法 (2022)
  • Author(s): 越智ありさ、櫻井明子、太田浩二、飛永恭兵、若林龍也、脇野修、右手浩一、冨永辰也
  • Organizer: 第４５回日本分子生物学会年会