フィブリノゲン蓄積病モデル細胞を用いたフィブリノゲン機能解析と蓄積動態の解明
Project/Area Number |
21K15945
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Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Review Section |
Basic Section 53010:Gastroenterology-related
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Research Institution | Shinshu University |
Principal Investigator |
新井 慎平 信州大学, 学術研究院保健学系, 助教 (70866053)
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Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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Keywords | フィブリノゲン / フィブリノゲン蓄積病 / 免疫沈降 / 大量培養 / ローラーボトル / セルスタック / 先天性フィブリノゲン異常症 / フォールディング異常 / ケミカルシャペロン |
Outline of Research at the Start |
近年、一部の先天性フィブリノゲン(Fbg)異常症において、産生された異常Fbgが細胞外に分泌されずに肝細胞の小胞体に蓄積し、肝細胞障害・肝硬変を引き起こすFbg蓄積病(Fbg Storage Disease;FSD)の存在が明らかとなってきた。本研究では、FSDモデル細胞を用いて、細胞外に分泌されるFbgと小胞体内に蓄積するFbgの違いを明らかにするとともに、FSD発症のメカニズムの解明に取り組む。さらに、小胞体蓄積を抑制・改善する物質の候補を探索し、それらの効果を検証して将来の治療薬の開発に繋げることを目的としている。
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Outline of Annual Research Achievements |
申請者は、これまでにフィブリノゲン蓄積病(FSD)報告例の遺伝子変異を対象に、リコンビナントフィブリノゲン(Fbg)安定発現細胞株を樹立し、それらのFSDモデル細胞を用いたFSDの病態解明に取り組んでいる。2022年度は、これまでに樹立したFSDモデル細胞のうち、G284R・D316N・R375Wの遺伝子変異を有する3種類のモデル細胞株について、小胞体に蓄積したFbgをターゲットにした解析に取り組んだ。 細胞内に蓄積したFbgを回収するために、小胞体内タンパクを特異的に標識する色素と反応させ、その反応色素に対する抗体とプロテインAビーズを用いた免疫沈降法によるFbg回収を検証した。免疫沈降法で得られたサンプルをSDS-PAGEで確認したところ、CBB染色でFbgのバンドは確認できなかったが、Westernblottingではバンドの存在を確認可能であった。様々な条件でFbgの高濃度回収を試みたが、標識色素を用いた免疫沈降法では困難であると判断し、標識色素の代わりに抗Fbg抗体を使用した免疫沈降法(代替法)を検証したところ、CBB染色でFbgのバンドを確認することができ、十分量の細胞内Fbgを回収することが可能となった。SDS-PAGEで得られたFbgバンドを切り出し、ゲル内トリプシン消化を行った後、液体クロマトグラフィー質量分析計(LC-MS)を用いてFbgと結合しているタンパクの同定を行う予定である。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
標識色素を用いた免疫沈降法ではターゲットとした小胞体内Fbgの回収が難しく、抗Fbg抗体を用いた免疫沈降法への変更を行った。当初の計画では年度内に質量分析計による解析が終了している予定であったが、現在その解析に取り組んでいるため「やや遅れている」と判断した。
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Strategy for Future Research Activity |
2023年度は、小胞体ストレスに起因する疾患への治療薬として研究されているケミカルシャペロンに着目して、フィブリノゲン蓄積病の治療薬候補を検証する。先行研究で効果が証明されている数種類のケミカルシャペロンを選択し、モデル細胞における反応性(治療効果)を細胞内Fbg濃度や細胞内封入体の陽性率等の指標で判定していく予定である。
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Report
(2 results)
Research Products
(11 results)
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[Journal Article] Automated screening procedure for phenotype of congenital fibrinogen disorder using novel parameters, |min1|c and Ac/|min1|c obtained from clot waveform analysis of Clauss method2021
Author(s)
Arai S, Kamijo T, Kaido T, Yoda M, Shinohara S, Suzuki T, Arai N, Sugano M, Uehara T, Okumura N.
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Journal Title
Clinica Chimica ACTA
Volume: 521
Pages: 170-176
DOI
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Peer Reviewed
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