COPDにおける鉄代謝に着目した新たな治療法の確立

• Project/Area Number: 21K16133
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 53030:Respiratory medicine-related
• Research Institution: Yamagata University
• Principal Investigator: 佐藤 正道 山形大学, 医学部, 助教 (90613050)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 慢性閉塞性肺疾患 / 鉄代謝 / ヘム蛋白合成 / アミノレブリン酸合成酵素 / ALAS-1 / COPD

Outline of Research at the Start

我々は今までのコホート研究、動物実験の結果から『血清鉄の低値はヘム蛋白合成低下が喫煙曝露への炎症応答を増悪させ、COPDの増悪因子となる』と仮説を立てた。本研究では、ヘム蛋白合成経路のアミノレブリン酸合成酵素（Aminolevulinic acid synthase; ALAS）遺伝子改変マウスを用いて、この仮説を検討する。将来的には疾患進行抑制の観点から新たな治療法を確立することを目標とする。

Outline of Annual Research Achievements

慢性閉塞性肺疾患（COPD）は、タバコ煙などの有害物質を長期間吸入曝露することにより、肺局所だけでなく全身性の炎症が引き起こされる疾患とされている。しかし喫煙者の全員がCOPDを発症するわけではなく、何らかの喫煙感受性因子が存在していることが示唆されている。当施設で我々が行ってきた疫学研究では血清鉄の低値が喫煙者の経年的な呼吸機能低下に関与することが明らかとなっている。さらに動物実験により血清鉄の低下が喫煙による肺局所の炎症を誘導し、肺気腫を増悪させることを示した。鉄欠乏状態では、酸化ストレス応答に関与するヘム蛋白の合成が低下することから「細胞内鉄欠乏によるヘム蛋白合成低下が喫煙曝露への炎症応答を増悪させる」と仮説を立てた。本研究ではヘム蛋白低下状態における肺細胞への喫煙曝露の影響を検証し、ヘム代謝に着目した新規治療法への可能性を検討することを目的とした。
前年までの研究でヘム合成蛋白（Aminolevulinic acid synthase（ALAS）-1）ヘテロノックアウトマウス（BDF1マウス）に対して喫煙曝露による肺気腫を誘導したが、対照群と比較して差異を認めなかった。さらに肺胞上皮細胞株をALAS-1阻害薬で前処置し、タバコ抽出液によるアポトーシスを誘導したが、ALAS-1の前処置によるアポトーシスの増強を認めなかった。
当年度はALAS-1の発現の相違によって、貧血や鉄欠乏状態にはなっていないが、細胞内のヘム代謝に変動を来しているかを検証した。細胞内ヘム濃度は細胞内ミトコンドリア膜電位の変動を観察することで間接的に測定した。培養細胞をALAS-1阻害薬により処理した後にJC-1染色を行ったところ、ミトコンドリア膜電位が上昇し、ミトコンドリア内のヘム合成阻害が起こっていることが示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

我々はこれまでの研究で、鉄欠乏状態が肺内の炎症を増強し、COPDの組織学的病態を悪化させることを示した。しかし、血清鉄の低下は低酸素の影響を無視することができないため、肺内の炎症が純粋に鉄代謝によるものかを検証することが困難と考えられた。そこで我々はヘムタンパク質を構成する鉄に着目した。体内で鉄は、主にヘモグロビン鉄として利用されているが、他にヘムタンパク質の補欠分子族として生体に重要な役割を果たしている。鉄欠乏状態はヘモグロビンではなく、他のヘムタンパク質の合成低下を引き起こして、COPDを増悪させているという仮説を検証することとした。
我々はヘム蛋白合成経路のアミノレブリン酸合成酵素（Aminolevulinic acid synthase; ALAS）代謝に着目した。ALAS-1の代謝は赤血球中のヘム蛋白に影響を及ぼさないため、ヘモグロビンの生合成に影響せずに、他のヘム蛋白の合成低下を起こすことが期待された。ALAS-1遺伝子改変マウスを用いて肺気腫形成を誘導する実験を行ったが、対照群と比較して肺気腫の形成に差を認めなかった。また培養細胞系でALAS-1の合成阻害を行ったが喫煙刺激による細胞のアポトーシスに差を認めなかった。
そこでALAS-1の発現の相違によって、貧血や鉄欠乏状態にはなっていないが、細胞内のヘム代謝に変動を来しているかを検証した。培養細胞系を用いて、細胞内ヘム濃度の変化により細胞内ミトコンドリア膜電位の変動が生じることで細胞内ヘム蛋白の変動を間接的に証明した。肺胞上皮細胞株、気道上皮細胞株へALAS-1阻害薬を投与し、JC-1染色を行うことでミトコンドリア膜電位の変化を検証した。その結果ミトコンドリア膜電位がコントロール群に比べて上昇しており、ミトコンドリア内のヘム合成阻害が誘導されていることが示唆された。

Strategy for Future Research Activity

ALAS-1の発現の相違によって、貧血や鉄欠乏状態にはなっていないが、細胞内のヘム代謝に変化を起こしていることを証明した。しかしALAS-1の発現変化により喫煙曝露による培養細胞のアポトーシスは変化を認めず、動物への喫煙曝露による肺気腫の変化は認めなかった。
今後はマウスに対し強制的にヘム蛋白を発現させる実験を行い、生体にどのような変化が起こるかを検討する。具体的にはアミノレブリンサン（ヘムタンパクの前駆物質）をマウスに投与し、肺組織中のHeme Oxygenase 1やミトコンドリア分裂を促進するGTP 結合タンパク質 dynamin-related protein 1 (Drp1)を測定する実験を計画している。最終的にヘム蛋白の発現変化によって、肺組織を中心とした生体にどのような影響が出てくるかを検証する計画である。

Research Products

• [Journal Article] Secretoglobin 3A2 suppresses cigarette smoke-induced pulmonary emphysema. (2023)
  • Author(s): Kurotani R, Ono S, Miyano Y, Nakayama S, Liu H, Aibara D, Sakahara S, Sato M, Sato K, Inoue S, Shibata Y, Lee MP, Abe H, Kimura S.
  • Journal Title: Journal of Int J Biochem Cell Biol. Volume: 157 Pages: 106390-106390
  • DOI: 10.1016/j.biocel.2023.106390
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effect of hyperhomocysteinemia on a murine model of smoke-induced pulmonary emphysema. (2022)
  • Author(s): Nakano H, Inoue S, Minegishi Y, Igarashi A, Tokairin Y, Yamauchi K, Kimura T, Nishiwaki M, Nemoto T, Otaki Y, Sato M, Sato K, Machida H, Yang S, Murano H, Watanabe M, and Shibata Y.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 12 Issue: 1 Pages: 12968-12968
  • DOI: 10.1038/s41598-022-16767-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Role of CC Chemokine Ligand 17 in Mouse Models of Chronic Obstructive Pulmonary Disease (2022)
  • Author(s): Machida Hiroyoshi、Inoue Sumito、Igarashi Akira、Saitoh Shinichi、Yamauchi Keiko、Nishiwaki Michiko、Nemoto Takako、Otaki Yoichiro、Sato Masamichi、Sato Kento、Nakano Hiroshi、Yang Sujeong、Furuyama Kodai、Murano Hiroaki、Ishibashi Yu、Ota Takahito、Nakayama Takashi、Shibata Yoko、Watanabe Masafumi
  • Journal Title: American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology Volume: 66 Issue: 4 Pages: 428-438
  • DOI: 10.1165/rcmb.2021-0069oc
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The Incidence and Risk Analysis of Lung Cancer Development in Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Possible Effectiveness of Annual CT-Screening. (2021)
  • Author(s): Machida H, Inoue S, Shibata Y, Kimura T, Ota T, Ishibashi Y, Murano H, Furuyama K, Yang S, Nakano H, Sato K, Sato M, Nemoto T, Nishiwaki M, Yamauchi K, Igarashi A, Watanabe M.
  • Journal Title: Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. Volume: 16 Pages: 739-749
  • DOI: 10.2147/copd.s287492
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Association between low mean corpuscular hemoglobin and prognosis in patients with exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. (2021)
  • Author(s): Sato K, Inoue S, Ishibashi Y, Ota T, Murano H, Furuyama K, Yang S, Machida H, Nakano H, Sato M, Nemoto T, Nishiwaki M, Yamauchi K, Igarashi A, Watanabe M.
  • Journal Title: Respir Investig. Volume: 59 Issue: 4 Pages: 498-504
  • DOI: 10.1016/j.resinv.2021.01.006
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 血清CCL17/TARCが肺癌薬物治療後の薬剤性肺障害発症の予測因子となりうるか？ Can serum CCL17/TARC be a predictor of the development of drug-induced lung injury after drug treatment for lung cancer? (2022)
  • Author(s): 宮崎収，佐藤正道，花輪翁有，石橋悠，邨野浩義，峯岸幸博，佐藤建人，根本貴子，西脇道子，山内啓子，五十嵐朗，井上純人，渡辺昌文
  • Organizer: 第62回日本呼吸器学会学術講演会
• [Presentation] 気管支鏡検査の硫酸アトロピンによる前処置と心拍数，血圧の関連 Relationship between pretreatment of bronchoscopy with atropine sulfate and heart rate and blood pressure (2022)
  • Author(s): 花輪翁有，五十嵐朗，宮崎収，石橋悠，邨野浩義，峯岸幸博，佐藤建人，佐藤正道，根本貴子，西脇道子，山内啓子，井上純人，渡辺昌文
  • Organizer: 第62回日本呼吸器学会学術講演会
• [Presentation] Thymus and activation-regulated chemokine（TARC）KOマウスを用いたCOPDの病態についての検討 Examination of the pathophysiology of COPD using Thymus and activation-regulated chemokine（TARC）KO mouse (2021)
  • Author(s): 町田浩祥，太田隆仁，石橋 悠，邨野浩義，古山広大，梁 秀鼎，中野寛之，佐藤建人，根本貴子，西脇道子，山内啓子，佐藤正道，五十嵐朗，井上純人，渡辺昌文
  • Organizer: 第61回日本呼吸器学会学術講演会
• [Presentation] 肺気腫形成にホモシステインが及ぼす影響の検討 Effects of homocysteine on emphysema formation. (2021)
  • Author(s): 邨野浩義，町田浩祥，中野寛之，佐藤建人，佐藤正道，五十嵐朗，井上純人，柴田陽光
  • Organizer: 第61回日本呼吸器学会学術講演会