糸球体上皮細胞におけるRho-GTPase制御機構を解明する

Research Project

Project/Area Number	21K16164
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 53040:Nephrology-related
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	松田潤大阪大学, 大学院医学系研究科, 特任助教(常勤) (10778260)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000) Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000) Fiscal Year 2021: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Keywords	糸球体上皮細胞
Outline of Research at the Start	Rho-GTPaseは細胞内のアクチン骨格を制御する蛋白群である。近年、糸球体上皮細胞（ポドサイト）におけるRho-GTPase活性の異常が細胞形態に変化をもたらし、尿蛋白を引き起こすことが明らかとなってきた。本研究ではポドサイトのRho-GTPase活性がどのように調節されているかを解明する。尿蛋白は慢性腎臓病（CKD）の予後予測因子であることから、CKD進展に歯止めをかける新規治療の開発へと繋げたい。
Outline of Annual Research Achievements	Rho GTPaseは細胞内アクチン線維の分解・再構築を制御し、細胞形態に重要な役割を果たしている。Rho GTPaseはGuanine nucleotide Exchange Factors (GEF)によって活性化され、GTPase-Activating Proteins (GAP)によって不活化される。これまでの研究から、糸球体上皮細胞（ポドサイト）の代表的なRho GTPaseの1つであるRac1の活性異常が尿蛋白や糸球体硬化に関わることが示されているが、その制御機構は明らかでない。そこで本研究では近位依存性ビオチン標識法により、ポドサイトにおけるRac1のGEF、GAPおよびその他関連因子の同定を試みた。その結果、GEFではARHGEF7やFGD6が、GAPではARHGAP31やARHGAP10などが検出され、ポドサイトのRac1活性は主にこれらのGEFとGAPによって制御されていることが示唆された。また、GEF・GAP以外にGIT2がRac1関連因子として同定された。培養ポドサイトを用いた免疫染色によりGIT2の細胞内局在を評価したところ、GIT2は接着斑構成蛋白の1つであるパキシリンと共局在していた。樹立したGIT2欠損ポドサイトでは対照細胞と比較してRac1活性の上昇を認めた。GIT2欠損細胞の面積は対照細胞と比較して有意に増加し、Rac1阻害剤を投与することにより有意に減少した。以上より、ポドサイトのGIT2は接着斑に局在し、Rac1活性を制御することで細胞形態の維持に関わると考えられた。 CRISPR/Cas9によりGIT2欠損マウスを樹立した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 計画どおりに研究を実施し、都度適切なトラブルシューティングを実行できたためと思われる。
Strategy for Future Research Activity	樹立した動物モデルを用いて生体におけるGIT2の機能解析を行う。また、GIT2欠損細胞を用いて、GIT2がRac1活性を亢進する分子メカニズムを解明する。