| Project/Area Number |
21K16173
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 53040:Nephrology-related
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
小林 洋輝 日本大学, 医学部, 助教 (70802156)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | NBL1 / BMP-7 / EMT / 糖尿病性腎症 / NBL１ / 腎線維化 / BMP antagonist / 慢性腎臓病 / オミクス |
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| Outline of Research at the Start |
申請者は糖尿病性腎症患者を対象にした血漿中蛋白の網羅的測定で、腎保護作用を持つBone morphogenetic protein -７のantagonistである蛋白Xが将来の末期腎不全(ESRD)を強力に予測するバイオマーカーであることを明らかにした。さらに蛋白Xは慢性腎臓病患者の近位尿細管細胞で高発現し、動物実験では、蛋白X ノックアウト(KO)マウスが一側尿管結紮(UUO)により誘導した腎線維化に対して抵抗性であることを見いだした。
そこで本研究ではこれらの成果をさらに発展させ、蛋白Ｘの近位尿細管細胞における発現調節機構、及び糖尿病性腎症における役割について明らかにすることを目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者はBone Morphogenetic Protein(BMP)-7のantagonistであるNeuroblastoma suppressor of tumorigenicity 1(NBL1)が将来の末期腎不全(ESRD) を強力に予測するバイオマーカーであることを明らかにした。またNBL1KOマウスが、UUOにより誘導した腎線維化に対して抵抗性があることがわかったが、腎線維化に関与する分子機序や、糖尿病性腎症でのNBL1の役割は未知であるため、これらを明らかとすることを目的とした。
1) ヒト近位尿細管細胞であるHK-2細胞に、NBL1のsiRNAをトランスフェクションし、DMEM無血清培地でserum starvaitonを24時間行った後、TGFβ1 (5ng/ml)を培地に添加し４８時間刺激した。これらの細胞から蛋白を回収し、western blotを行った結果、negative control siRNAでは、TGFβ1の刺激によって、EMTのマーカーであるE-cadherinの発現がDMEM培地と比べて減少したが、NBL1 siRNAをトランスフェクションした細胞では、E-cadherinの減少が抑制された。またαSMAの発現は、negative control siRNAでは、その発現が上昇したが、NBL1 siRNAでは、コントロールsiRNAと比べると発現が低下していた。現在は、SMAD1/5、SMAD2/3のリン酸化への影響を検討中である。
2) NBL1 KOマウス(ホモタイプ、ワイルドタイプ)を、麻酔下で右腎摘出を行った後に高脂肪餌を与え、ストレプトゾトシンを投与して糖尿病マウスを作成した。糖尿病発症確認後24週まで飼育後に麻酔下で心臓より全採血を行い、臓器を採取した。現在、組織でのmRNA、タンパクの発現解析や、組織染色を行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト尿細管細胞であるHK-2細胞を用いた培養実験では、NBL1をノックダウンさせることにより、TGFβ１の刺激によるEMTの誘導が抑制されることがわかった。また動物実験においては、NBL1 KOマウスは、片腎摘後に高脂肪餌を負荷し、STZを投与して糖尿病を発症させた。このマウスを24週間飼育後、組織を摘出し、現在解析を行っており、本研究課題の進捗状況は概ね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、培養実験では、今年度行ったNBL1 siRNAを導入した実験において、刺激因子を高血糖（33mMグルコース）にし、EMTマーカー(αSMA、Eーcadherin、vimentin)やCOL4A、SMAD1/5、SMAD2/3のリン酸化への影響を検討する。NBL1 KOマウス(ホモタイプ、 ワイルドタイプ)の糖尿病モデルマウスを使用した動物実験では、得られた組織について、さらに解析を進め、腎臓に対するNBL1の役割を検討する。
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