I型アレルギー反応の決定的セルグリシン：肥満細胞分泌顆粒への輸送機構

• Project/Area Number: 21K16311
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 54020:Connective tissue disease and allergy-related
• Research Institution: Aichi Medical University
• Principal Investigator: 塩入 達政 愛知医科大学, 分子医科学研究所, 助手 (40896891)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
• Keywords: セルグリシン / グリコサミノグリカン

Outline of Research at the Start

セルグリシンはヘパリン鎖を付加した小型のプロテオクリカンで、肥満細胞の分泌顆粒において 蛋白質分解酵素やヒスタミン等の活性アミンと結合し、これらの分子群を分泌顆粒内に高濃度に蓄積することから、I型アレルギー反応の鍵を握る分子と考えられている。しかしなぜ他のプロテオグリカンが細胞外へ放出されるのに対し同分子のみがヘハパリンを付加し、分泌顆粒に局在するのかは 解明されていない。本研究の目的は、肥満細胞におけるセルグリシンの分泌顆粒への輸送機構を、 他のプロテオグリカンとの局在の比較によって明らかにすることである。

Outline of Annual Research Achievements

セルグリシン (Serglycin、以下SRGN) はヘパリン鎖を付加した小型のプロテオグリカンで、肥満細胞の分泌顆粒においてタンパク質分解酵素やヒスタミン等の活性アミンと結合し、これらの分子群を分泌顆粒内に高濃度に蓄積することから、I型アレルギー反応の鍵を握る分子と考えられている。しかしなぜ他のプロテオグリカンが恒常的に細胞外へ放出されるのに対し同分子のみがヘパリンを付加し、分泌顆粒に局在するのかは解明されていない。本研究の目的は、肥満細胞における SRGNの分泌顆粒への輸送機構を、他のプロテオグリカンとの局在の比較によって明らかにすることである。
SRGNの細胞内輸送を継時的に観察するためにラット好塩基球性白血病細胞株(RBL-2H3)に対して、可逆的タンパク質繋留法(RUSH: Retention using selective hooks法)を使用してSRGNの細胞内輸送を観察した。RUSHシステムは目的分子を小胞体内に局在させ、ビオチンの添加で分子の輸送を開始させ目的分子の輸送過程を経時的に追跡することが可能なライブイメージングを用いた技術である。これによりSRGNの細胞内での継時的局在変化を共焦点顕微鏡により観察した。さらにRUSHシステムにBioID（近位依存性ビオチン標識）法を組み合わせることで細胞内輸送関連タンパク質の同定を目指した。BioID酵素にはビオチンフェノール基質とすることで近傍タンパク質を非特異的にビオチン化させるAPEX２酵素を使用した。同酵素を使用することによりビオチンを基質とするRUSHシステムと併用することが可能となる。現在、上記の方法を駆使して研究を遂行中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

RUSHシステムとBioIDを組み合わせた実験系はHEK293では問題なく発現し質量分析に使用できることが確認されたがRBL-2H3細胞へのプラスミドの導入効率が著しく低く分析可能なスケールでタンパク質を回収することが困難であり、導入方法の検討を行っている。

Strategy for Future Research Activity

引き続きRUSHシステムとBioIDを組み合わせた手法でSRGN細胞内輸送に関わるタンパク質の同定を目指す。またSRGNの細胞内輸送を規定するコアタンパク質領域を検討するため遺伝子改変を行い細胞内輸送の変化を検討する。