Characterization of bacteriophage virulence for persister cells

Research Project

Project/Area Number	21K16331
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 54030:Infectious disease medicine-related
Research Institution	National Institute of Infectious Diseases
Principal Investigator	近藤恒平国立感染症研究所, 薬剤耐性研究センター, 研究員 (60896554)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000) Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2021: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Keywords	バクテリオファージ / パーシスター / 薬剤耐性菌
Outline of Research at the Start	細菌の集団中には、抗菌薬に抵抗性を示す細胞（パーシスター）が一定数存在し、薬剤耐性遺伝子の伝播を促進することが明らかとなっている。一方、パーシスターに対する効果的な抗菌薬はいまだ開発されておらず、潜在的なリスクは高いと考えられる。近年、細菌に感染するウイルスであるバクテリオファージ（ファージ）が薬剤耐性菌の新たな治療薬として注目されているが、パーシスターに対してファージが十分な殺菌効果を示すかについては、未解明な部分が多い。本研究ではファージがパーシスターに対して十分な感染効率と殺菌効果を有するかを詳細に評価する。
Outline of Annual Research Achievements	パーシスターとは代謝の低下に伴い増殖が抑制された細胞小集団のことで、抗菌薬に対して抵抗性を示す。抗菌薬を除くと再び増殖を始めるが、元の集団と同じく抗菌薬に対して感受性を表す。パーシスターに対するファージの殺菌効果を詳細に調べるために、代表的なファージ（T1、T4、T5、T7）を用いて様々な環境条件下における殺菌能力を調べた。ほとんどのファージ（T1、T4、T7ファージ）がさまざまな環境条件下で存在するパーシスターを殺菌することがわかった。さらに、抗菌薬に細菌を暴露した後に残存したパーシスターに対してはT4とT7が効率よく殺菌した。一方で、T1ファージは抗菌薬に暴露して生き残った細胞を殺菌することができなくなっていた。一段階増殖実験を行ったところ、T1ファージは特定の抗菌薬の存在下で子ファージを全く生産しないことが示された。パーシスターは環境の変化により通常の細胞の代謝に復帰するため、培地上ではファージの感染がパーシスターの状態の細胞で成立したのか、通常の細胞活動に復帰した際に成立したのかを区別することが困難である。そこで、ファージの殺菌効果を即時的に観察するために、細菌の代謝活性を測定する試薬で染色し、顕微鏡下でファージと混合して観察したところ。代謝活性の高い菌に対しては100%に近い効率で殺菌したが、低代謝活性の細菌の40%程度がファージによって直ちには殺菌されないことがわかった。おそらくファージは低代謝活性の細胞に吸着しているものの細菌の活性が低すぎるためファージが増えることができないと考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初に計画していた通りに、複数のファージに対するパーシスターの殺菌効果を様々な環境条件下で評価し、自然由来のファージがパーシスターに対して強い殺菌効果を示すことがわかってきた。また、当初予定していたライブイメージングを用いたパーシスターへの即時的な感染の評価も行うことができた。ライブイメージング解析により、低い代謝を有する細胞のうち、60%程度がファージによって殺菌される一方で、一部殺菌されない細胞も存在することが示唆された。
Strategy for Future Research Activity	これまでの解析は大腸菌K12株のみで解析を行なってきたため、今後は当初の計画通りに近年問題となっている臨床由来の薬剤耐性菌を宿主とし、それらに感染するファージを採取して、殺菌能力を評価していきたい。、