| Project/Area Number |
21K16652
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 56020:Orthopedics-related
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
石塚 真哉 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (40813316)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | ヒアルロン酸 / 変形性膝関節症 / マウス / DMM / HAS2 |
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| Outline of Research at the Start |
ヒアルロン酸の関節注射は膝OAに対して多くの基礎・臨床研究により除痛・抗炎症効果が示されており、膝OAに対する保存治療として現在広く行われている。一方で、膝への頻回の注射による痛み、感染症の可能性、また最も重要な点として投与された、中・高分子ヒアルロン酸は、そのほとんどが軟骨細胞へ到達できていないなどの問題点が存在する。本研究は、軟骨深層まで到達可能であるウイルスベクターを用いてヒアルロン酸合成酵素であるHAS2を軟骨細胞、滑膜細胞に遺伝子導入し、内因性ヒアルロン酸の発現を亢進させ、OA膝に対する効果を検証する
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請時に記載したIn vitroの先行研究に続くin vivo実験として、研究計画にあったDMM OAモデルマウスの作成を行い、OA変化が生じていることの確認を行うため、DMM OAモデルマウスを作成後、マウス膝関節を採取し、組織標本を悪性後、HE染色、サフラニンO（S-O）染色などをおこなった。OAモデルマウスにおいてはS-O染色において濃染するプロテオグリカンに富んだ組織が大きく減少しており、プロテオグリカンの喪失が生じていることを確認した。DMM OAモデルマウスの作成に関しては確認ができたと考えている。
また同組織における免疫組織化学染色を行いMMP-3、-13の発現解析により各種分解酵素のタンパクの発現上昇、局在を確認した。上記の作成したDMM OAモデルマウスを用いて、現在本研究と平行してその効果に関する研究を行っているヒアルロン酸合成阻害剤である4-Methylumbelliferone, 4-MUをマウス膝関節内に投与し、上述した各種OA変化が抑制されることを確認した。それらの成果は「Journal of orthopaedic research, 2020」で報告されている。同様にDMM OAモデルマウスを作成し、膝関節でHAS2を恒常的に過剰発現するアデノウイルスベクター（Adeno-HAS2-ZsGreen）を膝関節に投与、ベクターによる遺伝子導入がされるか、OAの進行が抑制されるかについての実験を行ったところ、膝関節組織切片のS-O染色においてHAS2の過剰発現のウイルスベクターを注入することで染色性の低下が抑制されることを見出だし、その結果を「Orthopaedic research society 2024」で発表している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
上記に加え、現在免疫組織化学染色（IHC）にて各種たんぱく分解酵素の分子の発現抑制を行っているところである。標的蛋白としてはMMP-13, ADAMTS-4, 5などとしており、組織切片の作成、染色の条件調整に時間がかかっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
DMM OA model mouseの膝関節内にAd-HAS2-ZsGreenを膝関節内に投与、その後に2, 4, 8, 12週で膝関節の組織切片を作成、膝関節内でのヒアルロン酸の産生をHyaluronan binding protein (HABP) 染色にて評価、ヒアルロン酸の分子量をHA-ELISAで評価、またHE染色、サフラニンO染色でOAの進行度を評価する。また免疫組織化学染色でMMP13、ADAMTS-4の発現の評価を行いHAS2 の過剰発現による抗炎症作用に関する評価を行う。
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