| Project/Area Number |
21K16742
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 56030:Urology-related
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
篠原 麻由香 大分大学, 医学部, 客員研究員 (30774666)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | decorin / 外尿道括約筋 / 増殖 / 分化 / 尿失禁 / デコリン / 細胞外マトリクス / 尿道括約筋 / 細胞外マトリックス |
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| Outline of Research at the Start |
外尿道括約筋は、尿失禁を防止する機能をもった横紋筋であるが、加齢とともに減少することが明らかにされており、その機序解明と有効な治療の探索は喫緊の課題である。我々は世界で初めてヒト外尿道括約筋幹細胞を分離培養して不死化細胞株を樹立し、これまで加齢に伴う増殖/抑制因子の機構を明らかにしてきた。その中で、細胞外マトリックスのひとつであるdecorinが外尿道括約筋幹細胞において他の横紋筋よりも高発現していることを見出した。本研究はこのdecorinの機能解析を、特にヒト外尿道括約筋幹細胞と他の横紋筋の差異、個体差・性差に着目して行い、外尿道括約筋の増殖/再生を介した尿失禁の新規治療法の開発を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
不死化ヒト外尿道括約筋細胞（US2KD）にリポフェクション法にてdecorinを過剰発現させた細胞株（US2KD/DCN）を使用し、昨年に引き続き筋増殖・分化についてWTとの比較を行った。qRT-PCR、WB法ともに、WTと比較してUS2KD/DCNの方が分化に伴ってdecorinの発現が多い傾向にあった。qRT-PCRではWTと比較してUS2KD/DCNの方が分化後のMHCⅠの発現が有意に増加していたが、MHCⅡではWTの方が発現が有意に増加していた。WB法では両者の分化後のMHCの発現に大きな差はみられなかった。次に分化初期に発現するmyogeninの発現を確認した。qRT-PCRではUS2KD/DCNにおいてmyogeninの発現が分化2日目に急激に増加していた。
次にUS2KDにDCNsiRNAをトランスフェクションしDCNノックダウンUS2KD細胞株（US2KDsiDCN）を作成した。Growth testではUS2KDsiDCNはWTと比較し増殖が抑制されていた。WTとUS2KDsiDCNをそれぞれ培地に播種し、培養2日目に分化誘導培地に変更して培養し、両者の筋分化に関わる実験を行った。RT-PCR法ではUS2KDsiDCNはWTと比較してMyosin Heavy Chain（MHC）Ⅰ、Ⅱの発現が有意に減少しており、myogeninもUS2KDsiDCNの方が有意に発現が減少していた。
また、複数の個体から採取したヒト外尿道括約筋をもとにhTERTのみを遺伝子導入し長寿化したヒト外尿括約筋初代培養細胞を獲得している。初代ヒト外尿道括約筋細胞株として筋増殖分化に使用できることを確認し、現在decorinの過剰発現株を作成しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
実験にかける時間が十分とれず、実験計画にやや遅れが生じている。
また、女性の外尿道括約筋組織検体がなかなかないため性差に注目した実験に遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
不死化ヒト外尿道括約筋細胞（US2KD）より前年度までに確立できたヒト外尿道括約筋decorin過剰発現細胞株（US2KD/DCN）、およびdecorinノックダウン株（US2KDsiDCN）において、筋増殖・分化について抑制および促進に作用している因子の特定およびシグナル伝達について引き続き検証する。また、hTERTのみを導入した長寿化ヒト外尿道括約筋細胞においても同様の検証を行い、細胞株としての意義、また性差における外尿道括約筋の違いについても検証を行う。
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