単一T細胞トランスクリプトーム解析による妊娠高血圧腎症治療のバイオマーカー探索

• Project/Area Number: 21K16764
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 56040:Obstetrics and gynecology-related
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 津田 さやか 富山大学, 学術研究部医学系, 助教 (60839075)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2021: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
• Keywords: 制御性T細胞 / CD4陽性T細胞 / 妊娠高血圧腎症 / T細胞受容体 / トランスクリプトーム解析 / 妊娠 / 抗原特異的T細胞 / 妊娠高血圧症候群

Outline of Research at the Start

胎児は母体にとって父親由来抗原を発現する半異物であるが、妊娠中は父親抗原特異的な免疫応答の抑制（免疫寛容）が誘導されるため、胎児は拒絶されない。父親抗原特異的な免疫寛容の誘導には、母体の父親抗原特異的制御性T細胞(Treg)が重要な役割を果たす。母体高血圧・胎児胎盤循環不全を呈する妊娠高血圧腎症（PE）の発症には、抗原特異的Tregの機能障害が関与する。今回、単一細胞からT細胞受容体と網羅的mRNA発現の同時解析を行うことで、抗原特異的Tregに特徴的に発現する機能分子を明らかにする。これにより、抗原特異的Tregをターゲットとした治療薬選定に繋げる。

Outline of Annual Research Achievements

正常妊娠初期(n=4)、正常妊娠後期(n=3)、妊娠高血圧腎症（PE)(n=3)の子宮内膜リンパ球、正常妊娠後期(n=1)の末梢血リンパ球からCD4陽性細胞をセルソーターで分離し、BD Rhapsody single cell analysis systemを用いて単一細胞mRNA＋T細胞受容体(TCR)を施行した。発現変動のある遺伝子をもとに、クラスタリング解析を施行したところ、12種類のconventional CD4陽性細胞(Tconv)分画（ナイーブ、メモリー、活性化、PD-1+抑制型）と、FoxP3+制御性T細胞(Treg)の計13の分画から成るヘテロな集団であることが判明した。PD-1陽性抑制型、活性化型、Treg分画では細胞のクローン化率が高く抗原特異的クローンを含む群であることが分かった。CD4+Tconvはメモリー型・活性化型・PD-1+抑制型クラスター間にクローン重複があり、局所での抗原刺激を受け分化していることが示唆された。一方、Treg分画で増加しているクローンは他の分画とほぼ重複せず、Tconvとは異なる抗原を認識しており、誘導経路も異なると考えられた。興味深いことに、PEでは、Treg分画のクローナリティが高い細胞にRORC、IL18といったproinflammatoryな形質の獲得を示唆するmRNAの発現が増加しているものが存在した。また、PEのTreg分画でSTAT1の発現が亢進していた。T細胞でのSTAT1のoverexpressionは自己免疫疾患発症のリスク,病態関連分子であることが報告されている。STAT1-JAK経路の阻害は免疫学的治療のターゲットとなりうる。PEにおいてもTregにおけるSTAT-1強発現が病態関連分子である可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Ⅰ. 正常妊娠とPE症例で、抗原特異的Tregの機能分子発現を比較検討し、免疫学的治療の標的となる病態関連分子を明らかにする。（2021-2022年度）
PEでは抗原特異的Tregがproinflammatoryな形質に傾斜していることを示唆する所見が得られた。また、自己免疫疾患における病態関連分子としての既報があるSTAT1の発現亢進が、PEのTreg分画でも認められた。以上よりⅠの目標は達成された。
Ⅱ. 妊娠子宮で機能する抗原特異的Tregの誘導過程を明らかにする。（2021-2022年度）
TregとCD4+Tconvは認識する抗原と誘導経路が異なる可能性が示唆された。マウスでは、Tregは所属リンパ節で抗原提示されexpansionしたものが子宮へ誘導されていると報告されており、ヒトでも同様の誘導経路である可能性が示唆された。一方、子宮局所でTconvがPD-1＋subsetへ分化している可能性が示唆され、母子境界領域で免疫寛容の誘導メカニズムの一つかもしれない。以上が判明したことによりⅡの目標も概ね達成されたと考えられる。

Strategy for Future Research Activity

PEでのTreg分画における病態関連分子の同定と、TregとCD4+Tconvの誘導経路の違いを明らかにすることができたため、論文作成・投稿を行う。

Research Products

• [Journal Article] Chloroquine is a safe autophagy inhibitor for sustaining the expression of antioxidant enzymes in trophoblasts. (2023)
  • Author(s): Furuta A, Shima T, Yoshida-Kawaguchi Mihoko, Yamada K, Yasuda I, Tsuda S, Yamaki-Ushijima A, Yonede S, Higashisaka K, Cheng SB, Matsumoto K, Tsutsumi Y, Sharma S, Saito S, Nakashima A
  • Journal Title: J Reprod Immunol. Volume: 155 Pages: 103766-103766
  • DOI: 10.1016/j.jri.2022.103766
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Dynamics of neuropilin1 (Nrp1)-positive thymus-derived and Nrp1-negative peripherally induced paternal antigen specific regulatory T cells in the uterus and spleen during pregnancy in mice. (2023)
  • Author(s): Araishi K, Shima T, Yasuda I, Tsuda S, Morita K, Yamaki-Ushijima A, Nakashima A, Saito S
  • Journal Title: J Reprod Immunol Volume: 155 Pages: 103792-103792
  • DOI: 10.1016/j.jri.2022.103792
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Probiotics including Clostridium butyricum, Enterococcus faecium, and Bacillus subtilis may prevent recurrent spontaneous preterm delivery. (2022)
  • Author(s): Arai NA, Yoneda S, Yoneda N, Ito M, Tsuda S, Shiozaki A, Nohira T, Hyodo H, Kumazawa K, Suzuki T, Nagasaki S, Makino S, Saito S.
  • Journal Title: J Obstet Gynaecol Res Volume: 48 Issue: 3 Pages: 688-693
  • DOI: 10.1111/jog.15166
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The role of decidual regulatory T cells in the induction and maintenance of fetal antigen-specific tolerance: Imbalance between regulatory and cytotoxic T cells in pregnancy complications. (2021)
  • Author(s): Tsuda S, Nakashima A, Morita K, Shima T, Yoneda S, Kishi H, Saito S.
  • Journal Title: Hum Immunol. Volume: S0198-8859 Issue: 5 Pages: 00040-9
  • DOI: 10.1016/j.humimm.2021.01.019
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular and immunological developments in placentas. (2021)
  • Author(s): Nakashima A, Shima T, Aoki A, Kawaguchi M, Yasuda I, Tsuda S, Yoneda S, Yamaki-Ushijima A, Cheng SB, Sharma S, Saito S.
  • Journal Title: Hum Immunol. Volume: S0198-8859 Issue: 5 Pages: 00033-1
  • DOI: 10.1016/j.humimm.2021.01.012
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Aggrephagy Deficiency in the Placenta: A New Pathogenesis of Preeclampsia. (2021)
  • Author(s): Nakashima A, Shima T, Tsuda S, Aoki A, Kawaguchi M, Furuta A, Yasuda I, Yoneda S, Yamaki-Ushijima A, Cheng SB, Sharma S, Saito S.
  • Journal Title: Int J Mol Sci. Volume: 22 Issue: 5 Pages: 2432-2432
  • DOI: 10.3390/ijms22052432
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Preeclampsia complicated with maternal renal dysfunction is associated with poor neurological development at 3 years old in children born before 34 weeks of gestation. (2021)
  • Author(s): Yoneda N, Yoneda S, Tsuda S, Ito M, Shiozaki A, Niimi H, Yoshida T, Saito S
  • Journal Title: Front. Pediatr. Volume: 1 Pages: 1-10
  • DOI: 10.3389/fped.2021.624323
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Type 1 diabetes woman with repeated miscarriages successfully gave birth after introducing an insulin pump with a predictive low glucose suspend feature (2021)
  • Author(s): Honoki Hisae、Yagi Kunimasa、Tsuda Sayaka、Wada Tsutomu、Enkaku Asako、Nakagawa-Yokoyama Maki、Kamigishi Miki、Shikata Masataka、Takikawa-Nishiday Akiko、Fujisaka Shiho、Chujo Daisuke、Sasaoka Toshiyasu、Nakashima Akitoshi、Saito Shigeru、Tobe Kazuyuki
  • Journal Title: Diabetology International Volume: 12 Issue: 3 Pages: 324-329
  • DOI: 10.1007/s13340-020-00489-9
  • NAID: 40022593484
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] T細胞免疫の観点からみた妊娠維持機構と早産予防対策への提言. (2022)
  • Author(s): 津田 さやか
  • Organizer: 第38回日本産婦人科感染症学会学術集会
  • Invited
• [Presentation] Single-cell transcriptome and T cell receptor analysis revealed the diversity and phenotypic characteristics of decidual CD4+ T cells in normal pregnancies and preeclampsia. (2022)
  • Author(s): Sayaka Tsuda, Keiko Morita, Akemi Ushijima, Tomoko Shima, Akitoshi Nakashima, Shigeru Saito
  • Organizer: 第74回日本産科婦人科学会学術講演会
• [Presentation] T細胞による胎児の認識と許容のメカニズム解明への挑戦 (2022)
  • Author(s): 津田 さやか
  • Organizer: 第37回日本生殖免疫学会総会・学術集会
  • Invited
• [Presentation] 妊娠合併症におけるT細胞免疫の基礎と免疫療法への展望. (2022)
  • Author(s): 津田 さやか
  • Organizer: 第96 回日本薬理学会年会
  • Invited
• [Presentation] 合併症を持つ女性が安全に妊娠・出産するために～プレコンセプションケアの現場から～. (2022)
  • Author(s): 津田 さやか
  • Organizer: 富山県薬剤師会「妊産婦服薬支援のための薬剤師サポート機能強化事業」研修会
  • Invited
• [Presentation] 不育症や自己免疫性疾患を有する女性のプレコンセプションカウンセリング (2022)
  • Author(s): 津田さやか
  • Organizer: 第33回富山県母性衛生学会総会・学術集会
  • Invited
• [Presentation] 単一T細胞解析による母子間免疫寛容のメカニズム解明への挑戦 (2021)
  • Author(s): 津田さやか, 森田恵子, 七野成之, 島友子, 岸裕幸, 齋藤滋
  • Organizer: 第36回日本生殖免疫学会総会・学術集会
  • Invited
• [Book] Reproductive Immunology Basic Concepts volume1 (2021)
  • Author(s): Tsuda S, Saito S, Gil M
  • Total Pages: 462
  • Publisher: Academic Press
  • ISBN: 9780128185087
• [Book] 分娩・産褥期の正常と異常／周産期感染症 (2021)
  • Author(s): 藤井知行、永松 健、津田さやか、中島彰俊、齋藤滋
  • Total Pages: 392
  • Publisher: 中山書店
  • ISBN: 9784521747637