Novel Development of Gene Delivery for Inner Ear -Dual Vector Method-

Research Project

Project/Area Number	21K16832
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 56050:Otorhinolaryngology-related
Research Institution	Okayama University
Principal Investigator	大道亮太郎岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (20771299)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Completed (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000) Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2021: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
Keywords	遺伝子治療 / 遺伝性難聴 / アデノ随伴ウイルス / 有毛細胞 / 内耳 / 感音難聴 / 内耳遺伝子導入 / 遺伝子導入 / 遺伝子発現
Outline of Research at the Start	感音難聴は最も一般的な神経疾患の１つである。その病因は多岐にわたるが、騒音や加齢の要因をのぞくとそのほとんどが遺伝性難聴とサイトメガロウイルス胎内感染による難聴である。遺伝性難聴は新生児のうち500人に1人に発症し、すべての先天性感音難聴患者の50-60%をしめる。遺伝性難聴に対する検査の進歩により、補聴器や人工内耳による治療介入が可能となっている中で、それらは対症療法の範囲を出ない。根治的治療手段として遺伝子治療の開発が重要である。本研究は内耳に対する遺伝子治療に欠かすことのできない遺伝子を細胞に運搬する新しい手段として、Dual Vector法を応用したモデルを開発する。
Outline of Annual Research Achievements	これまでの検討で、蝸牛が成熟している生後4週目の野生型マウスに対し、Round window membrane + Canal fenestration法（以下RWM+CF法）で2種類のAdeno associated virus (以下AAV)を内耳に導入した。血清型タイプ２（以下AAV2）、血清型タイプ９（以下AAV9）を用い、それぞれのベクターには蛍光タンパクであるeGFP（緑色蛍光）とmCherry（赤色蛍光）を組み込んだ。その際の濃度は先行研究での濃度に合わせるように、各ベクター濃度はその半分の濃度とした。具体的な濃度は以下の通りである。注射後２週間目に聴性脳幹反応で聴力を評価したところ、注射された側の耳と対側の未治療の耳を比較しDual transductionによる聴毒性は認めないと判断した。聴力を評価した後に安楽死させた上で、側頭骨を採取し、内耳を取り出し、固定した。免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡による内有毛細胞及び外有毛細胞への感染率を検討した。 AAV2同士の組み合わせでは内有毛細胞への導入効率は96.92%とsingleの場合と同様に高効率であった。外有毛細胞に対しては、ApexとMiddleにおいて90%以上の高効率を認めた一方で、Baseに関しては効率が低下しており、全体としては65.59%と他家の報告よりも高値ではあったが、singleの効率と比較すると低下を認めた。 AAV9同士の組み合わせではBaseを除いてAAV9単独時の導入高率よりも有意に低下する傾向を認めた。 AAV2とAAV9の組み合わせではAAV2の感染率の低下は認めなかったが、AAV9の感染率は単独と比較して低下していた。 AAV2によるDual transductionは両有毛細胞においてsingleと同様に高率に導入されており、遺伝子治療における高い有用性が示唆された。