| Project/Area Number |
21K16929
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Review Section |
Basic Section 57010:Oral biological science-related
|
|---|
| Research Institution | Nagoya University |
|---|
Principal Investigator |
浦田 悠輔 名古屋大学, 医学部附属病院, 医員 (90897357)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
|
| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
|
|---|
| Keywords | XXYLT1 / Notchシグナル / O-グルコース / 扁平上皮癌 / O-グルコース糖鎖 / キシロース |
|---|
| Outline of Research at the Start |
口腔がんにおいても Notch シグナルの異常が、がんの発生や進展に極めて重要であることが次々と明らかとなっている。本研究では、NOTCH1 の不活性化により、その細胞増殖性が亢進する扁平上皮癌細胞株をモデルとして、ゲノム編集・遺伝子工学的手法を用いて、O-グルコース糖鎖のキシロース伸長のリモデリングを行い、糖鎖修飾の変化を超高感度質量分析計によって解析する。その後、キシロース伸長と NOTCH1 シグナルの活性化、そして扁平上皮癌細胞の悪性挙動との関連を明らかにする。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
1. XXYLT1 ノックアウト (KO) 細胞の作製：Notchシグナルを遮断する γセクレターゼ阻害薬により細胞増殖が変化した 扁平上皮癌細胞株の選別口腔扁平上皮癌細胞株, SAS 細胞、HSC3 細胞において、設計した gRNA、GFP を組み込んだ cas9 ベクターを SAS 細胞、HSC 細胞にトランスフェクションし、BD FACS Melody Cell Sorter を用い てシングルセルソーティングした。ソーティングした細胞を培養し、増殖させた後シークエンスを確認し、XXYLT1 をノックアウト (KO) した細胞を既報通り作製した [Urata et al. 2020 Cells]。
2.野生型、XXYLT1 KO 細胞における NOTCH1 活性化レベルの解析： Notch シグナルの活性化は、細胞を用いたレポーターアッセイにより評価している。Notchリガンドである Jag1 を発現する細胞をシグナル送信細胞として、また、Notch と Notchシグナル応答性のルシフェラーゼ遺伝子を発現する細胞をシグナル受信細胞として用いており、まだ繰り返し検討が必要だが、GXYLT1、XXYLT1 KO にて Notch シグナルの変化が確認されてきている。
また活性化した NOTCH1に対する特異抗体 Val1744 を用いて細胞抽出物のウェスタンブロット 解析をすることで、NOTCH１の活性化レベルの解析をしている。さらに、別の手段として、HES/HEY ファミリー遺伝子や c-MYC などの NOTCH1 標的遺伝子の発現レベルを RT-qPCR 法で測定する。
３ 細胞増殖性の解析：野生型、またXXYLT1KO 細胞を用いて細胞の増殖性を評価する。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
扁平上皮癌細胞において遺伝子導入の効率が先の研究で使用した HEK293T 細胞と比べはるかに落ちるため、質量分析を用いたOーグルコース糖鎖構造の解析において、Notchタンパク質の精製の効率が悪く、また細胞表面への輸送やリガンドバインディングアッセイをするためのフローサイトメトリーにおいて、
先の研究で用いた HEK293T 細胞と比べ、ディッシュへの接着が強く、また Notch1 細胞外ドメインにおける糖鎖構造に影響を与えないよう、トリプシンを用いずに細胞を回収する必要があり、これらの工程に関して難渋している。
またO-グルコース糖鎖のキシロース伸長の Notch シグナルへの影響を調べるためのレポーターアッセイにおいても、様々な試薬や、継代数など、条件検討を必要としており、別の影響としてリガンドコーティングをしたディッシュにNotchを強制発言させたSAS細胞を培養し、zcにより下流遺伝子の発現を解析しているが、コーティングのためのリガンドの量や、少ない細胞からの確実な結果を得るためのプロトコール確立のための条件検討に想定より時間がかかっており、全体としてやや遅れている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
質量分析による Oーグルコース糖鎖構造の解析のため、質量分析に必要な Notch タンパク質を精製し、糖鎖構造の解析を進め、トリプシンや、キモトリプシンなど様々な酵素処理をし、Oーグルコース糖鎖構造の解析を進めていく。またレポーターアッセイも繰り返し検討し、方法を確立させ研究を進め、その他、リガンドコーティングを用いたRT-PCRや Notch１細胞内ドメインを認識する、Val1744 抗体を用いウェスタンブロット、また細胞表面への輸送やバインディングもフローサイトメトリーでさらなる解析を進め、 Notch シグナルのキシロース伸長における影響について検討を進めていく予定である。また XXYLT１KO SCC 細胞の糖鎖構造がある程度確認できた後に、XXYLT1 KO細胞の細胞増殖能などを進めていく予定である。
|
