細胞膜の局所ナノスーツ膜化による細胞内外ナノ観察のためのMEMS液体セル

• Project/Area Number: 21K18190
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 28:Nano/micro science and related fields
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 石田 忠 東京工業大学, 工学院, 准教授 (80517607)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 林 智広 東京工業大学, 物質理工学院, 准教授 (30401574) ; 宮永 一彦 自治医科大学, 医学部, 准教授 (40323810)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥25,870,000 (Direct Cost: ¥19,900,000、Indirect Cost: ¥5,970,000); Fiscal Year 2023: ¥7,150,000 (Direct Cost: ¥5,500,000、Indirect Cost: ¥1,650,000); Fiscal Year 2022: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000); Fiscal Year 2021: ¥12,480,000 (Direct Cost: ¥9,600,000、Indirect Cost: ¥2,880,000)
• Keywords: 電子顕微鏡 / 細胞内観察 / 電子線透過膜 / リポソーム / 細胞融合

Outline of Research at the Start

生細胞の内外を同時に電子顕微鏡観察するための技術を開発する。細胞の外側の電子顕微鏡観察には超薄電子線透過膜越しの観察を行い、細胞の内側の電子顕微鏡観察には細胞膜を局所的に電子線透過膜に改変することで観察を行う。そのために、ナノ孔付きマイクロ流路デバイスを開発し、細胞の局所的電子線透過膜化において、細胞が死亡しない条件を模索する。金ナノ粒子を内包したリポソームを細胞融合することで、細胞内の標識を行う。これらの技術を組み合わせ、細胞内外の観察を可能とする。さらに、細胞に細菌を用い、バクテリオファージを感染させて、その時の細胞内外の変化をナノレベルで観察する。

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、①細菌のプロトプラスト化とその走査電子顕微鏡(SEM)観察と②細菌捕捉と局所試薬送達のためのナノ孔の開発、③細胞サイズリポソームの形成に取り組んだ。
①ナノ孔の形成：テトラメチルアンモニウムヒドロキシド(TMAH)を用いたSi異方性エッチングによるナノ孔形成では数umサイズの開口の形成しかできなかった。そこでSi異方性エッチングでSi基板に逆ピラミッド構造を形成し、最後に収束イオンビームを用いて逆ピラミッド構造の先端に500nmサイズの貫通開口を形成することに成功した。
②ナノ孔越しの細菌に対する薬剤送液：　枯草菌を1mmスリットで陰圧吸引して捕捉し、その上で蛍光液（模擬リゾチーム）を枯草菌の一部に送液した。リゾチームは30分程度の反応時間により細胞壁を除去することがわかっているため、局所送液を30分行った。下流方向に蛍光液は流出して枯草菌のスリット開口部だけでなく大部分が蛍光液で染色された。
③細菌サイズリポソームの形成：1 um程度の流路寸法のフローフォーカス構造を作製し、リポソームを形成したが6 um級の単分散性を有するリポソームが得られた。

Research Products

• [Journal Article] Microfluidic Technique for Electron Microscopy of In-Liquid Virus and Bacteria (2022)
  • Author(s): 石田忠
  • Journal Title: Journal of the Japan Society for Precision Engineering Volume: 88 Issue: 1 Pages: 5-8
  • DOI: 10.2493/jjspe.88.5
  • NAID: 130008139736
  • ISSN: 0912-0289, 1882-675X
  • Year and Date: 2022-01-05
• [Journal Article] Microfluidic Liquid Cell with Silicon Nitride Super-Thin Membrane for Electron Microscopy of Samples in Liquid (2022)
  • Author(s): Akihiko Sugihara, Tadashi Ishida
  • Journal Title: Biosensors Volume: 12 Issue: 12 Pages: 1138-1138
  • DOI: 10.3390/bios12121138
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Hydraulic microactuator with coarse/fine drive-switching mechanism (2021)
  • Author(s): Gai Yamauchi, Tadashi Ishida
  • Journal Title: Sensors and Actuators: A. Physical Volume: 332 Pages: 113082-113082
  • DOI: 10.1016/j.sna.2021.113082
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Microfluidic device for multiscale biology (2023)
  • Author(s): Tadashi Ishida
  • Organizer: Fall 2023 Seminar Series, Mechanical & Aerospace Engineering, UCLA
  • Invited
• [Presentation] Microfluidic Technologies to Study Biology from nm to mm Scales (2023)
  • Author(s): Tadashi Ishida
  • Organizer: International Symposium on Biomedical Engineering 2023
  • Invited
• [Presentation] マイクロ電極間の誘電泳動を用いた枯草菌プロトプラスト対の形成と電気的細胞融合技術の開発 (2022)
  • Author(s): 木内翠, 石田忠
  • Organizer: 日本機械学会 第34回バイオエンジニアリング講演会
• [Presentation] 枯草菌の電気的細胞融合の条件探索に向けた並列マイクロ対向電極の開発 (2022)
  • Author(s): 木内翠, 石田忠
  • Organizer: CHEMINAS46
• [Presentation] 金属被覆した寒天製マイクロ流路作製技術開発と培養性能評価 (2022)
  • Author(s): 関口大雅, 石田忠
  • Organizer: CHEMINAS45
• [Presentation] 収縮・膨張抑制による流路つき金属被覆寒天の電子線照射変形の低減 (2022)
  • Author(s): 関口大雅, 石田忠
  • Organizer: CHEMINAS46
• [Presentation] MEMS Probes in Electron Microscope for Nanotribology (2022)
  • Author(s): Tadashi Ishida
  • Organizer: IEEE NEMS 2022
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] MEMS for electron microscopy of liquid samples, (2021)
  • Author(s): Tadashi Ishida
  • Organizer: 32nd 2021 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 大気圧電子顕微鏡内における観察と操作を両立する光ピンセット技術の開発 (2021)
  • Author(s): 仁木 彰太, 石田 忠
  • Organizer: 日本顕微鏡学会 第64回シンポジウム
• [Remarks] 小俣石田研究室
  • URL: http://www.bmm.mech.e.titech.ac.jp/