Mycelial factory for production of biopharmaceuticals using synthetic biology

• Project/Area Number: 21K18224
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 40:Forestry and forest products science, applied aquatic science, and related fields
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 本田 与一 京都大学, 農学研究科, 教授 (70252517)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河内 護之 京都大学, 農学研究科, 特定准教授 (70771294) ; 中沢 威人 京都大学, 農学研究科, 助教 (80608141)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥26,000,000 (Direct Cost: ¥20,000,000、Indirect Cost: ¥6,000,000); Fiscal Year 2025: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000); Fiscal Year 2024: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000); Fiscal Year 2023: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000); Fiscal Year 2022: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2021: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
• Keywords: きのこ / 食用担子菌 / タンパク質分泌 / 小胞輸送 / 白色腐朽菌 / タンパク質分泌系 / ゲノム編集 / 糖鎖修飾 / ゴルジ体

Outline of Research at the Start

高額なバイオ医薬品を、進化的にユニークな真核生物である事がわかってきた担子菌（きのこの仲間）を利用して効率的に生産するためのシステム作りを目指す研究です。具体的には、ヒト型の糖鎖修飾酵素遺伝子を担子菌に人工的に導入し、培養後に発現誘導をかけることで、休止菌体を用いてヒト型糖鎖修飾された組換えタンパク質の生産を行います。研究が成功すれば、動物ウィルスの混入のないヒト型タンパク質を製造する技術が確立され、ガンやウィルスに対する抗体療法などを安心安全かつ安価に提供可能になることが期待されます。

Outline of Annual Research Achievements

高額なバイオ医薬品を、進化的にユニークな真核生物である事かがわかってきた担子菌(きのこの仲間)を利用して効率的に生産するためのシステム作りを目指す研究である。具体的には、ヒト型の糖鎖修飾酵素遺伝子を担子菌に人工的に導入し、培養後に発現誘導をかけることで、休止菌体を用いてヒト型糖鎖修飾された組換えタンパク質の生産を行うことを目指している。研究が成功すれば、動物ウィルスの混入のないヒト型タンパク質を製造する技術が確立され、ガンやウィルスに対する抗体療法などを安心安全かつ安価に提供可能になることが期待される。高マンノース型以降の修飾系をもたないという真核生物の共通祖先に通じると考えられるユニークな糖鎖修飾系を持つ事がわかった担子菌を用いて、ヒト型の糖鎖修飾系を合成生物学的な手法により導入して、休止菌体によるヒト型糖タンパク質の生産システム構築を目指す。このようにして生産されたヒト型糖タンパク質は、安価で安全なバイオ医薬品として活用されることが期待される。子嚢菌類とは進化的に異なるグループに属する担子菌を新たな産業用微生物として利用していく分野を開拓することが目標である。昨年度に引き続き、小胞体、ゴルジ体相当物、分泌小胞などのタンパク質分泌系を構成する様々な細胞内小器官に局在すると予想される複数のタンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質を組換えにより作成し、ヒラタケ細胞内におけるそれぞれの分泌系細胞内小器官の局在について調べた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

担子菌類におけるタンパク質分泌系の実態については、これまでに研究例があまり知られていない。我々の研究によって、分泌系の可視化が順調に進んでおり、今後の研究の基盤となるような成果が見られている。これまでの成果は、国際誌に査読付き論文として出版された。

Strategy for Future Research Activity

さらに多くの融合蛍光タンパク質を作成し、分泌系に関与する細胞内小器官の観察を行って、それぞれの器官の局在や相互関係について解明していく。特に、子のう菌で提唱されているような初期ゴルジ体と後期ゴルジ体を担子菌でも区別することができるのかどうかについて明らかにしていく。また、それぞれの器官にタンパク質を局在させるシグナルの同定についても着実に進めていく。

Research Products

• [Journal Article] Visualizing organelles with recombinant fluorescent proteins in the white-rot fungus Pleurotus ostreatus (2023)
  • Author(s): Kurebayashi Kazuhiro、Nakazawa Takehito、Shivani、Higashitarumizu Yuta、Kawauchi Moriyuki、Sakamoto Masahiro、Honda Yoichi
  • Journal Title: Fungal Biology Volume: 127 Issue: 10-11 Pages: 1336-1344
  • DOI: 10.1016/j.funbio.2023.09.002
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Double-gene targeting with preassembled Cas9 ribonucleoprotein for safe genome editing in the edible mushroom<i>Pleurotus ostreatus</i> (2023)
  • Author(s): Boontawon Tatpong、Nakazawa Takehito、Choi Yeon-Jae、Ro Hyeon-Su、Oh Minji、Kawauchi Moriyuki、Sakamoto Masahiro、Honda Yoichi
  • Journal Title: FEMS Microbiology Letters Volume: 370 Pages: 1-5
  • DOI: 10.1093/femsle/fnad015
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Gene targeting of dikaryotic <i>Pleurotus ostreatus</i> nuclei using the CRISPR/Cas9 system (2022)
  • Author(s): Yamasaki Fuga、Nakazawa Takehito、Oh Minji、Bao Dapeng、Kawauchi Moriyuki、Sakamoto Masahiro、Honda Yoichi
  • Journal Title: FEMS Microbiology Letters Volume: 369 Issue: 1
  • DOI: 10.1093/femsle/fnac083
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Marker-free genome editing in the edible mushroom, Pleurotus ostreatus, using transient expression of genes required for CRISPR/Cas9 and for selection (2022)
  • Author(s): Koshi Daishiro、Ueshima Hiroki、Kawauchi Moriyuki、Nakazawa Takehito、Sakamoto Masahiro、Hirata Mana、Izumitsu Kosuke、Sumita Takuya、Irie Toshikazu、Honda Yoichi
  • Journal Title: Journal of Wood Science Volume: 68 Issue: 1
  • DOI: 10.1186/s10086-022-02033-6
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 白色腐朽菌ヒラタケを用いた高密度液体培養株の作出 (2024)
  • Author(s): 大塚唯、河内護之、辻健也、 吉見啓、田中千尋、矢野成和、入江俊一、中沢威人、本田与一
  • Organizer: 日本木材学会大会
• [Presentation] CRISPR/Cas9 Technology in Mushrooms for Sustainable Future of the Planet and Human Health (2023)
  • Author(s): Yoichi Honda
  • Organizer: 10th International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Product
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ゲノム工学を用いた白色腐朽菌の科学と新たな可能性 (2023)
  • Author(s): 本田与一
  • Organizer: 日本木材学会生物劣化研究会
  • Invited
• [Presentation] Trans-nuclei CRISPR/Cas9 for safe genome editing technology in Pleurotus ostreatus (2023)
  • Author(s): Daishiro Koshi, Junko Sugano, Moriyuki Kawauchi, Takehito Nakazawa, Masahiro Sakamoto, Minji Oh, 〇Yoichi Honda
  • Organizer: 欧州菌類遺伝学会議
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ゲノム工学を用いた白色腐朽菌の科学と新たな可能性 (2022)
  • Author(s): 本田与一
  • Organizer: 日本木材学会生物劣化研究会
  • Invited
• [Presentation] Marker-free genome editing in the edible mushroom, Pleurotus ostreatus, using transient expression of genes required for CRISPR/Cas9 and for selection (2022)
  • Author(s): Daishiro Koshi, Moriyuki Kawauchi, Toshikazu Irie, Takehito Nakazawa, Masahiro Sakamoto & Yoichi Honda
  • Organizer: International Union of Microbiological Societies 2022
  • Int'l Joint Research