Mycelial factory for production of biopharmaceuticals using synthetic biology

• Project/Area Number: 21K18224
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 40:Forestry and forest products science, applied aquatic science, and related fields
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 本田 与一 京都大学, 農学研究科, 教授 (70252517)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河内 護之 京都大学, 農学研究科, 特定准教授 (70771294) ; 中沢 威人 京都大学, 農学研究科, 助教 (80608141)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥26,000,000 (Direct Cost: ¥20,000,000、Indirect Cost: ¥6,000,000); Fiscal Year 2025: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000); Fiscal Year 2024: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000); Fiscal Year 2023: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000); Fiscal Year 2022: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2021: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
• Keywords: 白色腐朽菌 / タンパク質分泌系 / タンパク質分泌 / ゲノム編集 / 糖鎖修飾 / ゴルジ体

Outline of Research at the Start

高額なバイオ医薬品を、進化的にユニークな真核生物である事がわかってきた担子菌（きのこの仲間）を利用して効率的に生産するためのシステム作りを目指す研究です。具体的には、ヒト型の糖鎖修飾酵素遺伝子を担子菌に人工的に導入し、培養後に発現誘導をかけることで、休止菌体を用いてヒト型糖鎖修飾された組換えタンパク質の生産を行います。研究が成功すれば、動物ウィルスの混入のないヒト型タンパク質を製造する技術が確立され、ガンやウィルスに対する抗体療法などを安心安全かつ安価に提供可能になることが期待されます。

Outline of Annual Research Achievements

高額なバイオ医薬品を、進化的にユニークな真核生物である事かがわかってきた担子菌(きのこの仲間)を利用して効率的に生産するためのシステム作りを目指す研究です。具体的には、ヒト型の糖鎖修飾酵素遺伝子を担子菌に人工的に導入し、培養後に発現誘導をかけることで、休止菌体を用いてヒト型糖鎖修飾された組換えタンパク質の生産を行います。研究が成功すれば、動物ウィルスの混入のないヒト型タンパク質を製造する技術が確立され、ガンやウィルスに対する抗体療法などを安心安全かつ安価に提供可能になることが期待されます。 高マンノース型以降の修飾系をもたないという真核生物の共通祖先に通じると考えられるユニークな糖鎖修飾系を持つ事がわかった担子菌を用いて、ヒト型の糖鎖修飾系を合成生物学的な手法により導入して、休止菌体によるヒト型糖タンパク質の生産システム構築を目指します。このようにして生産されたヒト型糖タンパク質は、安価で安全なバイオ医薬品として活用されることが期待される。子嚢菌類とは進化的に異なるグループに属する担子菌を新たな産業用微生物として利用していく分野を開拓することが目標です。咋年度は、小胞体、ゴルジ体相当物、分泌小胞などのタンパク質分泌系を構成する様々な細胞内小器官に局在すると予想される複数のタンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質を組換えにより作成し、ヒラタケに形質転換して、それぞれの分泌系細胞内小器官の局在について調べました。今年度は、ゴルジ体のうち初期および後期ゴルジ体に相当する器官に局在すると考えられるタンパク質を用いてさらに解析を進めました。一方で、基盤技術として必要なヒラタケにおけるゲノム編集技術の改善を進めました。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

担子菌類におけるタンパク質分泌越系の可視化が、世界に先駆けて進んでいるため。またヒラタケにおいて、より効果的で安全性の高いゲノム編集を可能にする基盤的な技術の改良も進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

ゴルジ体の内部の分画が可能かどうかについてさらに解析を進めるとともに、ヒト型の糖鎖修飾機能を持つ酵素遺伝子を、形質転換により導入し、分泌タンパク質の修飾糖鎖構造に変化があるか解析を行う。

Research Products

• [Journal Article] Double-gene targeting with preassembled Cas9 ribonucleoprotein for safe genome editing in the edible mushroom<i>Pleurotus ostreatus</i> (2023)
  • Author(s): Boontawon Tatpong、Nakazawa Takehito、Choi Yeon-Jae、Ro Hyeon-Su、Oh Minji、Kawauchi Moriyuki、Sakamoto Masahiro、Honda Yoichi
  • Journal Title: FEMS Microbiology Letters Volume: 370 Pages: 1-5
  • DOI: 10.1093/femsle/fnad015
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Gene targeting of dikaryotic <i>Pleurotus ostreatus</i> nuclei using the CRISPR/Cas9 system (2022)
  • Author(s): Yamasaki Fuga、Nakazawa Takehito、Oh Minji、Bao Dapeng、Kawauchi Moriyuki、Sakamoto Masahiro、Honda Yoichi
  • Journal Title: FEMS Microbiology Letters Volume: 369 Issue: 1
  • DOI: 10.1093/femsle/fnac083
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Marker-free genome editing in the edible mushroom, Pleurotus ostreatus, using transient expression of genes required for CRISPR/Cas9 and for selection (2022)
  • Author(s): Koshi Daishiro、Ueshima Hiroki、Kawauchi Moriyuki、Nakazawa Takehito、Sakamoto Masahiro、Hirata Mana、Izumitsu Kosuke、Sumita Takuya、Irie Toshikazu、Honda Yoichi
  • Journal Title: Journal of Wood Science Volume: 68 Issue: 1
  • DOI: 10.1186/s10086-022-02033-6
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Trans-nuclei CRISPR/Cas9 for safe genome editing technology in Pleurotus ostreatus (2023)
  • Author(s): Daishiro Koshi, Junko Sugano, Moriyuki Kawauchi, Takehito Nakazawa, Masahiro Sakamoto, Minji Oh, 〇Yoichi Honda
  • Organizer: 欧州菌類遺伝学会議
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] CRISPR/Cas9 Technology in Mushrooms for Sustainable Future of the Planet and Human Health (2023)
  • Author(s): Yoichi Honda
  • Organizer: 10th International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Product
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ゲノム工学を用いた白色腐朽菌の科学と新たな可能性 (2022)
  • Author(s): 本田与一
  • Organizer: 日本木材学会生物劣化研究会
  • Invited
• [Presentation] Marker-free genome editing in the edible mushroom, Pleurotus ostreatus, using transient expression of genes required for CRISPR/Cas9 and for selection (2022)
  • Author(s): Daishiro Koshi, Moriyuki Kawauchi, Toshikazu Irie, Takehito Nakazawa, Masahiro Sakamoto & Yoichi Honda
  • Organizer: International Union of Microbiological Societies 2022
  • Int'l Joint Research