| Project/Area Number |
21K18257
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 49:Pathology, infection/immunology, and related fields
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
鳥越 俊彦 札幌医科大学, 医学部, 教授 (20301400)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
久保 輝文 札幌医科大学, 医学部, 助教 (90580019)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥26,000,000 (Direct Cost: ¥20,000,000、Indirect Cost: ¥6,000,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2023: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2021: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
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| Keywords | HLA複合体 / T細胞抗原受容体 / pHLA multimer / 抗原エピトープ / がん免疫療法 / バイオマーカー / HLA multimer / シングルセル解析 / 腫瘍浸潤T細胞 / メラノーマ / HLA class I / Antigen peptide / がん抗原 |
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| Outline of Research at the Start |
T細胞がどのような構造の抗原ペプチドを認識しているのかを同定することは、自己免疫疾患、ウイルス感染症、がん免疫などの病態解明や診断・治療において極めて重要な課題であるが、抗原受容体遺伝子配列を決定したとしても、そのリガンドである抗原ペプチドの構造を知ることはできない。本研究は、１個のＴ細胞がどのようなアミノ酸配列の抗原ペプチドを認識するのかを解析するマルチマーライブラリー技術を新規に開発し、ヒトのがん組織に浸潤しているＴ細胞の抗原特異性を分析して、がんに対する免疫応答のメカニズム解明と免疫治療への応用を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1)Q-dot pHLA multimerの合成と性能評価
本年度は、Q-dot標識pHLA multimerの合成を実施し、性能評価を行った。ペプチド・HLA複合体のアセンブリには合成ペプチドチトとEmpty HLA multimerを混合する方法によって実施した。Q-dot標識pHLA multimerが、蛍光標識pHLA multimerを上回る感度を持つことを確認した。本技術については特許出願を準備中。barcode DNAを結合したpHLA multimerライブラリーを合成し、末梢血T細胞プールと反応させた。pHLA multimer陽性T細胞をソーティングし、barcode DNAのシークエンス解析によってT細胞に結合したpHLA multimerの種類と結合数を分析した。
(2)ヒト腫瘍浸潤T細胞を用いたTCR解析
昨年度に引き続き、今年度はヒト大腸がん組織の腫瘍浸潤T細胞を対象に、pHLA multimerライブラリー(蛍光標識)と反応させ、 pHLA multimerの結合したT細胞をフローサイトメーターによってソーティングした。がん精巣抗原に特異的なTCRをもつT細胞の検出を確認した。さらに、抗原特異的T細胞のシングルセルTCR遺伝子解析を実施し、TCRa鎖、b鎖のレパトワー分析を実施した。
(3)ヒト末梢血T細胞のTCRレパトワー解析とpHLA multimer解析
非小細胞肺がん患者の末梢血T細胞を分離し、TCR遺伝子解析によるレパトワー解析を実施した。化学放射線療法の前後でTCRレパトワーが変化した患者群では、その後に行われた抗PD-L1抗体治療の効果が高いことを見出した。新型コロナウイルス抗原pHLA multimerを作成し、健常人末梢血T細胞からウイルス特異的T細胞の検出に成功した。特許出願を実施。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Q-dot pHLA multimerの合成と性能評価に成功し、特許出願に着手した。
pHLA multimerの評価試験として、フローサイトメータを用いたヒト腫瘍浸潤T細胞のTCRレパトワー解析を実施し、pHLA multimer陽性T細胞のシングルセルTCR遺伝子解析に成功した。
一方で、In vitro translation法によって得られるペプチドの収量が少なく、pHLA multimerの合成に至らなかったため、本年度も合成ペプチドを用いてpHLA multimerライブラリーを合成した。
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| Strategy for Future Research Activity |
pHLA multimer結合T細胞をシングルセル解析によって分析するためには感度増強が必要である。本年度は、Q-dot pHLA multimerによる感度向上を試みたが、さらなる感度の向上が必要であり、multimerあたりのQ-dot結合数を高めることによって、解決できると考えられた。また次年度は、pHLA Dimer Technologyを用いてpHLAライブラリーを合成し、シングルセルTCR遺伝子解析を実施する計画である。 サンプルをヒト肉腫にも拡大して、腫瘍浸潤T細胞のシングルセルTCR遺伝子解析とpHLA multimer解析を実施する計画である。Q-dot pHLA multimer法に関しては特許出願を準備中である。
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