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膜タンパク質超集積化のための無細胞固相合成システムの開発

Research Project

Project/Area Number 21K18324
Research Category

Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)

Allocation TypeMulti-year Fund
Review Section Medium-sized Section 90:Biomedical engineering and related fields
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

佐々木 善浩  京都大学, 工学研究科, 教授 (90314541)

Project Period (FY) 2021-07-09 – 2026-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help
¥25,870,000 (Direct Cost: ¥19,900,000、Indirect Cost: ¥5,970,000)
Fiscal Year 2025: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2021: ¥6,760,000 (Direct Cost: ¥5,200,000、Indirect Cost: ¥1,560,000)
Keywords膜タンパク質 / 無細胞蛋白質合成 / 固相合成法 / 人工細胞
Outline of Research at the Start

Merrifieldはペプチド固相合成法の開発により1984年ノーベル賞を受賞した。しかしながら、この手法は水に不溶な膜タンパク質には適用できない。全タンパク質の半数以上を占める膜タンパク質の人工合成法の開発は、生物学、医学、薬学において極めて重要であるが、膜タンパク質の簡便な合成は未だ不可能である。本研究では、この膜タンパク質を固相システムにより大量合成する。従来、膜蛋白質は細胞を用いて合成されるが、その活性の低さ、時間・コスト等が非効率、バイオハザードの危険、などが問題である。本研究では、微粒子表面に担持した脂質膜に対し、無細胞合成法により発現した膜タンパク質の直接組み込みを行う。

Outline of Annual Research Achievements

全タンパク質の半数以上を占める膜タンパク質の人工合成法の開発は、基礎生物学、医学、薬学において極めて重要であるが、膜タンパク質の簡便な合成は未だ不可能である。本研究では、この膜タンパク質を固相システムにより大量合成する未踏科学技術に挑戦する。
従来、膜タンパク質は、大腸菌などで過剰発現させ、界面活性剤により可溶化したのち、膜に再構成して得られる。この手法は、活性保持が困難、時間・コスト等が非効率、バイオハザードの危険、など多くの問題が残されている。この問題の解決に向け、本研究では、微粒子表面に担持した脂質膜(脂質膜コート微粒子)に対し、無細胞合成法により発現した膜タンパク質の直接組み込みを行うことを目的に研究を行った。
研究遂行にあたり、以下の3点に焦点をあてて研究を遂行する。 1) 脂質膜コート微粒子の作製と評価、2)無細胞膜タンパク質合成と膜への組み込み、3) 膜タンパク質ハイブリッド微粒子の機能評価とバイオ応用。研究の4年目にあたる2024年度は、ひきつづき上記の項目1)および2)について重点的に研究を行うともに、3)のバイオ応用に関する新たな知見を得ることができた。
具体的には、開発した脂質膜透過法を用い、人工の脂質膜のみならず天然の生体膜を効率的にコア微粒子に被覆する手法を確立した。これに加え、複数の膜タンパク質を単一の微粒子に搭載するための手法の開発を目的として、固相合成法を実現するための条件の最適化を行った。さらに、細胞接着性の膜タンパク質の機能を用いた新たなバイオ応用の可能性を切り拓いた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2024年度においては、おもに1) 脂質膜コート微粒子の作製と評価、および、2) 無細胞膜タンパク質合成と膜への組み込み、について重点的に研究をおこなうとともに、3) 膜タンパク質ハイブリッド微粒子の機能評価とバイオ応用についても研究を推し進めた。以下に各研究項目における進捗状況をまとめた。
1)脂質膜コート微粒子の作製と評価:通常、膜タンパク質を保持するために用いられるリポソーム(中空球状の脂質膜)や生体膜ナノ粒子は、比較的不安定かつハンドリングも困難である。本年度は、コア微粒子としてシリカに加え、薬物を複合化可能な多孔質微粒子を合成し、この微粒子に人工膜および生体膜を被覆できることを明らかにした。
2)無細胞膜タンパク質合成と膜への組み込み:脂質膜コート微粒子の存在下で、再構築型の試験管内タンパク質合成系であるPURE systemを用いて、目的とする膜タンパク質を発現させた。今年度は、細胞接着関連の複数の膜タンパク質、ギャップジャンクションを形成するコネキシンや、タイトジャンクションを形成するクラウディンを発現させられることを、ウェスタンブロッティング、蛍光抗体標識などにより明らかにするとともに、それらの機能についても検討を進めた。
3)膜タンパク質ハイブリッド微粒子の機能評価とバイオ応用:脂質膜コート微粒子として、ナノサイズの空孔を有する多孔質シリカ微粒子を用いた系を構築し、この多孔質シリカ微粒子がモデル薬物を内包しうることを明らかにした。さらに興味深いことに、この系においては、その空孔中に細胞由来の可溶性成分を抽出できることも見出した。この結果は、天然の細胞外微粒子に近い機能を持つナノ粒子のデザインにおいて有用な知見である。

Strategy for Future Research Activity

1) 脂質膜コート微粒子の作製と評価、および、2) 無細胞膜タンパク質合成と膜への組み込み、については引き続き研究をおこなうが、今年度はおもに、3) 膜タンパク質ハイブリッド微粒子の機能評価とバイオ応用について検討をすすめる。まず、1)については、抗菌活性を有する銀ナノ粒子を用いる系をすでに予備的に見出しているため、この系のさらなる確立を目指す。また、生体膜を機能化する新たな手法として、細胞に過剰発現させた膜タンパク質を搭載する手法を見出したことから、この系についても検討を行う。加えて、生体膜を複数層で被覆する新たな系についても研究をすすめる予定である。2)については、モデル系で得られた予備的知見をもとに、細胞接着における膜タンパク質の作用機序を細胞系において明らかにすることを目指す。以上、1)、2)における知見を踏まえ、3) 膜タンパク質ハイブリッド微粒子の機能評価とバイオ応用を積極的に推し進める。まず、膜タンパク質の固相合成については、条件を最適化する中でフローリアクターを用いる系が最適であるとの知見を得たため、このフローリアクターを用いた合成システムを確立する。また、多孔質微粒子を用いた系においては、細胞への薬物送達を含めたバイオ応用について検討する。さらに、細胞接着膜タンパク質の機能として、従来あまり例のない天然の細胞接着タンパク質の阻害剤としての新たな機能について、組織形成に与える影響もふくめて検討をおこなう。

Report

(5 results)
  • 2024 Research-status Report
  • 2023 Research-status Report
  • 2022 Research-status Report
  • 2021 Comments on the Screening Results   Research-status Report
  • Research Products

    (66 results)

All 2025 2024 2023 2022

All Journal Article (16 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 15 results,  Open Access: 10 results) Presentation (50 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 2 results)

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    • Author(s)
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    • Journal Title

      Gels

      Volume: 11 Issue: 2 Pages: 108-108

    • DOI

      10.3390/gels11020108

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    • Author(s)
      Kawasaki Riku, Oshige Ayano, Kono Nanami, Yamana Keita, Hirano Hidetoshi, Miura Yamato, Yorioka Ryuji, Bando Kaori. Tabata Anri, Yasukawa Naoki, Sadakane Masahiro, Sanada Yu, Suzuki Minoru, Takata Takushi, Sakurai Yoshinori, Tanaka Hiroki, Sasaki Yoshihiro, Akiyoshi Kazunari et al.
    • Journal Title

      ACS Applied Materials & Interfaces

      Volume: 16 Issue: 36 Pages: 47137-47149

    • DOI

      10.1021/acsami.4c07650

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      Volume: 25 Issue: 1 Pages: 2404380-2404380

    • DOI

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      ACS Applied Materials & Interfaces

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      Volume: 24 Issue: 11 Pages: 9751-9751

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      Small

      Volume: 19 Issue: 12 Pages: 220615-220615

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      Volume: 3 Issue: 2 Pages: 231-241

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      河﨑 陸、大重 彩乃、河野 七海、水田 涼介 、佐々木 善浩、秋吉 一成、長崎 健、真田 悠生、鈴木 実、山名 啓太、池田 篤志
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      第73回 高分子討論会
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      横山 達大、原田 浩之、澤田 晋一、秋吉 一成、佐々木 善浩
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      第53回医用高分子シンポジウム
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      Ma Yunting、佐々木 善浩、高谷 光、秋吉 一成
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      第34回バイオ・高分子シンポジウム
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      谷 優祐、水田 涼介、澤田 晋一、秋吉 一成、佐々木 善浩
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      尾関 克哉, 水田 涼介, 佐々木 善浩, 秋吉 一成
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      第72回高分子討論会
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      鍬田 修佑, 澤田 晋一, 佐々木 善浩, 秋吉 一成
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      右京慶吾, 澤田晋一, 金尾英佑,佐々木善浩,秋吉一成
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      Yoshihiro Sasaki, Ryosuke Mizuta, Kiyofumi Katagiri, Kazunari Akiyoshi
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      11th International Conference on Fine Particle Magnetism
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Published: 2021-07-13   Modified: 2025-12-26  

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