オペロンmRNA間の塩基対形成による新規連続代謝反応の実現と応用
| Project/Area Number |
21K19063
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 38:Agricultural chemistry and related fields
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
宮腰 昌利 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (60755809)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2023: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | 転写後調節 / small RNA / 3'UTR / オペロン / 代謝 / 3´UTR |
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| Outline of Research at the Start |
先行研究により、大腸菌・サルモネラのTCAサイクル酵素群をコードするsucABCDオペロンmRNAの3´UTRと、酢酸代謝経路をコードするackA-ptaオペロンmRNAの5´UTRが塩基対形成することを明らかにした。リボソームはトランス翻訳機構によりmRNA分子間を乗り換えて翻訳を継続することが可能である。sucABCD mRNAとackA-pta mRNAが実際に大腸菌細胞内で共局在していることを1分子FISH法で解析し、トランス翻訳機構が2分子のmRNA間でも成立することを検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
原核生物のオペロンmRNAは複数のタンパク質をポリシストロニックにコードするだけでなく、その3´UTRから遺伝子発現制御能を持つsmall RNA (sRNA) を生成する。単独の転写産物として発現する通常のsRNAは、多くの場合標的mRNAの5´UTRと塩基対形成して、翻訳阻害もしくはmRNA分解を引き起こす。本研究は、mRNAの3´UTRからプロセシングを経て生成するsRNAが通常のsRNAと同様に、実際に細胞内で標的mRNAと塩基対形成するのか、もしくは3´UTRに制御配列を持つmRNA自体が標的mRNAと塩基対形成することが可能であるかを検証する。
共焦点レーザー走査型顕微鏡、活性化確率的光学再構築顕微鏡 (dSTORM)を用いてRNA局在を解析した。大腸菌の3´UTRプロセシングに必須のエンドリボヌクレアーゼであるRNase Eの野生株もしくは温度感受株を比較したところ、プロセシングの阻害によって制御性3´UTRと標的5´UTRの共局在性が減少する傾向にあることが示された。しかしながら、制御性3'UTRの標的5´UTRとの塩基対形成に必須の塩基を置換しても共局在性に変化が見られなかった。したがって、本研究の手法ではRNAの局在が定量的に解析できない可能性が示唆された。
mRNAの3´UTRからのプロセシングが制御性3´UTR由来sRNAによる標的遺伝子の制御に必須であるかを検証するため、mRNAの終止コドン直下流のRNase E切断サイトに塩基置換を導入した。3'UTRがmRNAから切り離されない状態では標的遺伝子の抑制が起きないことをウェスタンブロットで明らかにした。したがって、3´UTRに制御配列を持つmRNAではなく、切り離されたsRNAが標的mRNAと塩基対形成することで転写後調節が起きることが示された。この研究成果は論文の一部として2022年11月に発表した。
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Report
(3 results)
Research Products
(5 results)
