一過性発現法を用いた希少さび病菌由来エフェクター候補遺伝子の探索

• Project/Area Number: 21K19110
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 39:Agricultural and environmental biology and related fields
• Research Institution: Yokohama National University
• Principal Investigator: 平塚 和之 横浜国立大学, 大学院環境情報研究院, 教授 (30202279)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2022: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2021: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
• Keywords: 一過性発現系 / さび病菌 / アグロバクテリウム法 / 発光レポーター / 植物病原菌 / 一過性発現 / エフェクター / ゲノム解析 / 一過的発現解析

Outline of Research at the Start

さび病菌罹病組織の乾燥標本に包埋された寄生菌と宿主植物の遺伝情報を最新のDNA修復技術、解析技術を駆使して回収・解析する手法を用い、宿主と病原体の相互作用に関する新奇因子を得られた遺伝情報から探索する。さらに、それらの情報から当該遺伝子産物のコード領域を増幅し、蛍光タンパクレポーターとの融合タンパクを発現するコンストラクトを作成し、遺伝子銃を用いた一過的発現法により機能解析を行う。

Outline of Annual Research Achievements

メダケ赤衣病菌(Stereostratum corticioides)の冬胞子堆からの核酸抽出法について引き続き検討を加え、長鎖DNAの精製が可能な手法の確立を試みた。具体的には全ガラス製ホモジナイザーまたはガラスビーズを用いる磨砕抽出と、DNA精製キットを用いる方法でDNAを単離し、アガロースゲル電気泳動によって、得られたDNAサンプルの品質について評価した。その結果、電気泳動像はスメアリングが顕著で、20kb以上のDNA分画は少ないことが判明した。新鮮な試料をもちいてもこの傾向は変わらず、磨砕方法に問題がある可能性が考えられた。
一方、一過性発現系等については合成化合物ライブラリーを対象としたエンハンサー探索を継続するとともに、これまでに当研究室で見いだしたジャスモン酸メチルのアゴニスト類を比較検討した結果、Trifluoromethyl)pyridin-2-yl]benzenesulfonamideが導入遺伝子発現効率向上にもっと有効であることが判明した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

今年度は一過性発現系等に関しては十分な進捗があったが、長鎖DNA精製の問題点が解決出来ておらず、最終段階の実験であるさび病菌ゲノムDNAのベクターへのクローニングに進むことが出来なかったため。

Strategy for Future Research Activity

メダケ赤衣病菌試料からのゲノムDNAの高度精製は難易度が高い可能性も考えられるので、他のさび病菌試料を用いても検討する。また、今後はやや精製度が低いDNAを用いて、配列解析等の実験に進むことも想定している。