Biochemical and genetic studies on mesoderm differentiation in insects using silkworm mutants and their application to development of insect growth regulators

Research Project

Project/Area Number	21K19124
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 39:Agricultural and environmental biology and related fields
Research Institution	Gakushuin University
Principal Investigator	嶋田透学習院大学, 理学部, 教授 (20202111)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	李允求学習院大学, 理学部, 助教 (50847168)
Project Period (FY)	2021-07-09 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000) Fiscal Year 2021: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Keywords	中胚葉 / 鱗翅目昆虫 / メタボローム / リピドミクス / RNA-seq
Outline of Research at the Start	本計画は昆虫の発生における新規な生化学システムを解明しようとする挑戦的研究である。申請者らは、カイコの変異体「腎臓形卵」(ki)の原因が、新奇な酵素をコードする遺伝子の欠損であることを発見した。ki変異体の産む卵は外観が歪んでおり、胚子発生で中胚葉組織が形成されずに致死するという特徴的な表現型を示す。原因遺伝子がコードするタンパク質は、配列の特徴から、脂質合成に関与する酵素であると予想される。その機能解明および産業応用のために、変異体におけるトランスクリプトーム解析およびメタボロミクス解析を行う。
Outline of Annual Research Achievements	カイコの変異体「腎臓形卵」ki変異体のホモ接合の母蛾が産む卵は、外観が歪んでおり、胚発生の途中で中胚葉組織が形成されずに致死するという興味深い表現型を示す。研究代表者らは、ポジショナルクローニングにより、ki形質の原因が、新奇なペルオキシダーゼ様タンパク質をコードする遺伝子の欠損であることが明らかにしてきた。2021年度にメタボローム解析により脂質を網羅的に解析したが変異体で有意に変動する脂質を特定するに至っておらず、未知の生化学的機構に関与するタンパク質をコードしていると推定される。2022年度は、CRISPR/Cas9法により正常蚕の原因遺伝子をノックアウトする実験を行い、複数の変異系統を作出した。これら変異系統の多くは、ki変異体と同様に、卵形の異常と胚致死を伴う卵を産下した。 ki形質の原因遺伝子がコードするペルオキシダーゼ様タンパク質をクエリーとして、昆虫のみならず多様な動物のゲノム配列に対して網羅的な相同性検索を行い、相同配列の間の分子系統解析を実施した。その結果、当該遺伝子と明瞭なオーソロジーを示す配列は、チョウ目、ハエ目、甲虫目などの完全変態昆虫にのみ存在しており、不完全変態昆虫には存在しないことが明らかになった。また昆虫以外の節足動物においても、脊椎動物と同様に、オーソログと言える遺伝子は見出されなかった。したがって、このペルオキシダーゼ様タンパク質は、完全変態昆虫に特有の存在であると推定される。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason CRISPR/Cas9法により正常蚕の原因遺伝子をノックアウトする実験を行い、複数の変異系統を作出することに成功した。これら変異系統の多くは、ki変異体と同様に、卵形の異常と胚致死を伴う卵を産下した。この成功により、遺伝的背景を均一にした状態で比較メタボローム解析を行うことが可能になった。また、ki変異体の原因遺伝子がコードするペルオキシダーゼ様タンパク質に関して、動物における相同配列の分子系統解析を行った結果、オーソログが完全変態昆虫にのみ存在することを示すことができた。
Strategy for Future Research Activity	2022年度にCRISPR/Cas9法により、ki変異体の原因遺伝子であるペルオキシダーゼ様をノックアウトすることができたので、その表現型の評価を行うとともに、ノックアウト系統を活用して生理・生化学的解析を行う。